鏈格孢菌是在自然界中廣泛分布的一種常見植 物病原真菌和腐生真菌,它會破壞農(nóng)作物,導(dǎo)致采后 腐爛。貯藏期間水果蔬菜的大量腐爛與鏈格孢菌在 低溫下生長良好有關(guān),許多蔬菜水果很容易產(chǎn)生鏈 格孢菌。目前關(guān)于鏈格孢菌毒素檢測的標(biāo)準(zhǔn),只 有SN/T4259-2015《出口水果蔬菜中鏈格孢菌毒素 的測定液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法》標(biāo)準(zhǔn),且鏈格孢菌 毒素的檢出 限 為10μg/kg。而關(guān)于鏈格孢菌毒素 的限量規(guī)定則未見報道。
1 實驗部分
1.1 試劑與儀器
乙腈、甲 醇 (HPLC 純),美 國 Fisher公 司;甲 酸、NaCl(HPLC純),德國 CNW 公司;十八烷基三 氯硅烷(C18)吸 附 劑 (40~63μm),德 國 CNW 公 司;N-丙基乙二胺(PSA)吸附劑(40~63μm),德國 CNW 公司;石 墨 化 碳 墨 (GCB)吸 附 劑 (38~125 μm),德國 CNW 公 司;騰 毒 素(Ten)、鏈 格 孢 霉 素(ALT)、鏈 格 孢 酚 甲 基 乙 醚 (AME)、鏈 格 孢 酚 (AOH)4種 ATs標(biāo)準(zhǔn)品(質(zhì)量分?jǐn)?shù)>99.5%),德 國 Dr.E公司;紅棗樣品(來源于新疆地區(qū)不同生產(chǎn) 基地、農(nóng)貿(mào)市 場 和 超 市),樣 品 去 果 核 后,經(jīng) 勻 漿 后 -18 ℃冷凍保存?zhèn)溆谩? WatersXEVOTQ-S超 高 效 液 相 色 譜-串 聯(lián) 質(zhì) 譜儀,美國 Waters公司;MS3-basic型漩渦混合器, 德國IKA 公司;Sigma3-30k型離心機,德國 Sigma 公司;N-EVAPTM112 型 氮 吹 儀,美 國 Organoma- tion公司;昆山舒美KQ-600DE 型 超 聲 波 清 洗 器,江 蘇 昆 山 市超聲儀器公司;ULPHW-IV 型超純水機,四川優(yōu) 普超純科技有限公司。
1.2 實驗
1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制
分別稱?。玻恚珂?格 孢 酚 甲 基 乙 醚 (AME)、1 mg騰毒 素(Ten)、0.5 mg 鏈 格 孢 霉 素 (ALT)、10 mg鏈格孢酚(AOH)4種 ATs標(biāo)準(zhǔn)品,用乙腈配成 各10 mL 質(zhì) 量 濃 度 分 別 為 200 mg/L AME、100 mg/LTen、50mg/LALT、1000mg/LAOH 的單 個 標(biāo) 準(zhǔn) 儲 備 液,-18 ℃ 保 存。 分 別 取 0.5 mL AME、1mLTen、2mLALT、0.1mLAOH 的單個 標(biāo)準(zhǔn)儲備液,用乙腈定容至10mL,配制成質(zhì)量濃度 為10mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)液。
1.2.2 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/ MS)檢測條件
LC條件:ACQUITY UPLCBEH C18 色譜柱(100mm×2.1mm,1.7μm);流動相:體積分?jǐn)?shù)為 0.1%甲酸水溶液∶B 乙腈。梯度洗脫程序:0.0~ 0.50min(體 積 分 數(shù) 為 95% 甲 酸 水 溶 液),0.50~ 5.00min (體 積 分 數(shù) 為 95% ~5% 甲 酸 水 溶 液), 5.00min (體 積 分 數(shù) 為95%甲 酸 水 溶 液);流 速 為 0.4mL/min;柱溫箱為30 ℃;進樣體積為5μL。 MS條件:電 噴 霧 離 子 源(ESI),正 離 子 和 多 反 應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式,離子源溫度為150 ℃,脫溶劑 氣流速為800L/h,錐孔氣流速為50L/h,氬氣作為 碰撞氣,4種 ATs的監(jiān)測離子對及錐孔電壓等質(zhì)譜 參數(shù)見表1。
2 結(jié)果與分析
定容溶劑是影響質(zhì)譜分析過程中目標(biāo)分析物離 子化效率和峰形的重要因素之一。結(jié)合分析物的結(jié) 構(gòu)性質(zhì)和流動相體系特點,本實驗選取水和乙腈作 為定容溶劑,考察了不同水和乙腈體積比作為定容 溶劑對4種 ATs響應(yīng)和峰形的影響。當(dāng)水和乙腈體積 比 為 60∶40 時,AME 和 AOH 組分在質(zhì)譜上沒有響應(yīng);當(dāng)水和乙 腈體積比為40∶60時,Ten、ALT、AME和 AOH4 種 ATs峰型對稱性差,且均出現(xiàn)峰前 伸 的 現(xiàn) 象;當(dāng)水和 乙 腈 體 積 比 為50∶50時,4種 ATs 峰型對稱性好,且 響 應(yīng) 較 高。而 GCB 吸 附 劑 對 AME 和 AOH 組分有較強吸附作用,回收率相對較差 (低于40%)。通 過 比 較 C18和 PSA 吸 附 劑 對4種 ATs的凈化效率發(fā)現(xiàn),當(dāng)吸附劑用量為150mg時, 兩種吸 附 劑 對 Ten、ALT 和 AME 的 回 收 率 均 在 80%以上,而 對 于 AOH 組 分 的 凈 化 效 果,C18吸 附 劑要明顯高于 PSA 吸附劑。因此本實驗選取 C18用 量為150mg作為凈化條件。
3 結(jié)論
建立了同時測定紅棗中 Ten、AOH、AME 和 ALT4種 ATs超 高 效 液 相 色 譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析方 法。紅棗樣品經(jīng)甲酸乙腈提取,QuEChERS方法凈 化,采用 BEH C18色 譜 柱 分 離,體 積 分 數(shù) 為0.1% 甲酸-水和乙腈作為流動相梯度洗脫,4種 ATs有較 好的響應(yīng)和峰形。同時,通過基質(zhì)匹配外標(biāo)法定量, 有效地減少了基質(zhì)效應(yīng),提高了定量的準(zhǔn)確性。經(jīng) 方法學(xué)驗證,表明該方法的線性范圍、檢出限、定量 限、準(zhǔn)確度和精密度等均滿足殘留檢測方法確認(rèn)的 要求,適用于紅棗中4種 ATs的定性定量檢測。
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