材料與方法 

材料、試劑與儀器 

樹莓葉茶及嫩尖茶樣品: 湖北金莓科技發(fā)展有限公 司生產(chǎn), 其中樹莓葉茶樣品為 2 個批次; 綠茶炒青(特級, 南京溧水生產(chǎn))。 鞣花酸標準品(98%)、沒食子酸標準品(99%)、蘆丁標 準品(99%)、福林酚(2 mol/L)(上海 Sigma 公司); 乙醇、甲 醇(色譜純)、三氯化鋁、丙酮、濃鹽酸、碳酸鈉、濃硫酸、 醋酸-醋酸鈉緩沖液、過硫酸鉀、蒽酮、1, 1-二苯基-2-三硝 基苯肼(DPPH 溶液)、2, 2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸) 二銨鹽(ABTS 溶液) (分析純, 上海 Sigma 公司) EX–200A 型電子天平(慈溪天東衡器廠); 759 型紫外 可見分光光度計(上海菁華科技有限公司); PL–5–B 型低速 離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠); KQ-100DE 數(shù)控超聲波清洗 儀(昆山超聲儀器有限公司)。 

實驗方法

總黃酮含量測定

(1) 樣品處理 準確稱取 0.50 g 干燥并研碎的茶葉于錐形瓶中, 按 1:80(m:V, g/mL)的料液比, 加入 40 mL 50%乙醇溶液, 70 ℃水浴回流提取 5 h, 濾紙過濾, 殘渣用 8 mL 50%乙醇 洗滌, 定容至 50 mL 備用。 

(2) 標準曲線 精密稱取蘆丁標準品 16.8 mg, 用 50%的乙醇溶液溶 解, 定容至 50 mL, 分別吸取上述蘆丁標準液 160、200、 240、280、320、360 ?L 至 10 mL 試管中, 加水補至 2.6 mL, 加入 1.5%AlCl3 1.6 mL 和 pH 5.4 的醋酸-醋酸鈉緩沖液0.8 mL, 搖勻, 室溫避光靜置 30 min, 于 415 nm 下測定其 吸光度值, 以吸光度值為縱坐標, 蘆丁的含量(mg)為橫坐 標, 繪制標準曲線。 

(3) 樣品的測定 吸取樣品液 400 ?L 進行測定。方法同 2.2.1(2), 根據(jù) 回歸方程計算總黃酮含量(mg/g, 以蘆丁計)。 

總多酚含量測定 

(1) 樣品處理 方法同 2.2.1(1)。 

(2) 標準曲線 準確稱取 17.0 mg 沒食子酸, 用純凈水溶解, 定容至 10 mL, 混勻, 稀釋 3 倍后備用。分別移取 40、60、80、100、 120、140 ?L 至 10 mL 試管中, 加水補至 500 ?L, 再加入 2.5 mL 0.2 mol/L 福林酚試劑混合, 在 0.5~8 min 內(nèi)加入 2 mL 7.5%碳酸鈉溶液, 充分混合。將上述混合標準溶液在 室溫下避光放置 60 min 后, 在 765 nm 波長下測定吸光值。 以吸光度值為縱坐標, 沒食子酸濃度(mg/mL)為橫坐標, 繪制標準曲線。 

(3) 樣品的測定 將樣品液稀釋適當?shù)谋稊?shù)(5~10)進行測定。方法同 2.2.1(2), 根據(jù)回歸方程計算總多酚含量(mg/g, 以沒食子 酸計)。 

鞣花酸含量測定

(1) 樣品處理 精確稱取樹莓葉茶 0.50 g, 加 入 50%甲醇溶液 100 mL(內(nèi)含 1 mL 濃 HCl 及 0.2 g Vc), 浸提 12 h, 然后 90 ℃回流 3 h, 過濾, 殘渣用 10 mL 甲醇洗滌, 濾液 60 ℃ 減壓濃縮至干, 殘渣用色譜純甲醇溶解, 定容至 25 mL 容 量瓶中。經(jīng) 0.45 μm 的微孔膜過濾備用。 

(2) 色譜條件 柱型號: Inertsil ODS-SP-C18 柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm); 柱溫: 30 ℃; 流速: 1 mL/min; 檢測波長 254 nm; 梯度洗脫程序: A 為甲醇, B 為 1%乙酸水: 0~25 min, 50%A; 25~30 min, 50%~60%A; 35~36 min, 60%~100%A; 36~ 45 min, 100%A; 45~50 min, 50%A; 進樣體積 10 μL. 

(3) 標準曲線 精密稱取鞣花酸標準品 0.95 mg 于 10 mL 容量瓶中, 用色譜純甲醇溶解, 超聲 5 min, 冷卻至室溫, 定容至刻度, 搖勻。經(jīng) 0.45 μm 的微孔膜過濾, 制成 0.095 mg/mL 的標 準品溶液。按色譜條件對鞣花酸標準品溶液進行檢測, 以 鞣花酸質(zhì)量(μg)為橫坐標, 峰面積為縱坐標, 繪制標準曲 線。根據(jù)標準曲線計算樣品鞣花酸含量。 

抗氧化活性測定 

清除 ABTS 自由基活性測定 配制 2 mL 7 mmol/L 的 ABTS 溶液, 吸取 35 μL 140 mmol/L 的過硫酸鉀溶液至 ABTS 溶液中, 室溫避光放 置 12~16 h, 形成 ABTS 儲備液。將 ABTS 儲備液用超純水稀釋約 120 倍即為 ABTS 工作液, 酶標儀測定其 734 nm 下 的吸光度值為 0.550。取 2.2.1 的備用樣液稀釋 25~100 倍, 在 96 孔板中, 分別加入稀釋后的樣品液 5、10、15、20 μL, 用超純水補至每孔 50 μL, 然后再加入 200 μL ABTS 工作 液, 反應(yīng)體系 250 μL, 振蕩混勻, 30 min 后測定其 734 nm 下的吸光度(Ai); 取 50 μL 50%乙醇溶液代替樣品溶液測得 空白吸光度(AC); 以 200 μL 超純水代替 ABTS 混合液測得 樣品本底吸光度(Aj), 按公式(1)計算樣品的清除率, 并根 據(jù)不同濃度樣品清除率的曲線計算 IC50 值。

總多酚標準曲線如圖 1, 由圖可知, 總多酚含量 X(以 沒食子酸計)與 765 nm 下的吸光度值 Y 的回歸方程為 Y=10.796X+0.0232, r 2 =0.9993, 表明沒食子酸濃度在 0~0.159 mg/mL 范圍內(nèi)線性良好。

樹莓嫩尖茶清除 DPPH 自由基的活 性最強, 半數(shù)有效濃度僅為 69.3 μg/mL 其次為特級炒青, 2 個樹莓葉茶樣品清除 DPPH 自由基的活性相近, 均顯著低 于樹莓嫩尖茶, 半數(shù)有效濃度為樹莓嫩尖茶的 5.4 倍。特 級炒青清除 ABTS 自由基的活性最強, 半數(shù)有效濃度僅為 8.41 μg/mL, 其次為樹莓嫩尖茶, 樹莓葉茶清除 ABTS 自 由基的活性較低, 半數(shù)有效濃度為樹莓嫩尖茶的 11~12 倍。這可能主要是由于不同種類茶葉的多酚含量決定的。

樹莓葉茶和嫩尖茶的鞣花酸含量較為豐富, 最高達 26.75 mg/g, 是特級炒青 6.8 倍以上。樹莓葉茶和嫩尖茶的總黃酮含量達 18~22 mg/g, 也略高于綠茶特級炒青 (16.44 mg/g)。樹莓嫩尖茶的總多酚含量同特級炒青接近, 均超過 180 mg/g。樹莓葉茶的總多酚含量較低, 僅為綠茶 和樹莓嫩尖茶 36~39%。

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