1 材料與方法
1.1 材料與試劑
地皮菜:山西忻州農(nóng)貿(mào)市場(chǎng);氯化硝基四氮唑藍(lán) (nitroblue tetrazolium chloride,NBT)、吩 嗪 硫 酸 甲 酯 (phenazine methosulfate,PMS)、還原型輔酶 1(nicoti- namide adenine dinucleotide,NADH)、二苯基苦基苯肼 (DPPH)、2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二 銨鹽(ABTS):Sigma 公司;試劑均為分析純。 大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、LB 培 養(yǎng)基:忻州師范學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供。
1.2 儀器
紫外-可見分光光度計(jì)(UV-1800):上海美譜達(dá)儀 器有限公司;超聲波清洗器(KQ-400KDE):昆山舒美超聲儀器有限公司;超凈工作臺(tái)(SW-CJ-2F):蘇州凈化 設(shè)備有限公司;全自動(dòng)高壓蒸汽滅菌鍋(D-1):上海喬 躍電子有限公司;恒溫恒濕生化培養(yǎng)箱(HWS-150): 北京中興偉業(yè)儀器有限公司。
1.3 試驗(yàn)方法
1.3.1 地皮菜活性成分的提取
地皮菜水洗,烘干、粉碎、過篩 60 目篩。稱取5.000 g 地皮菜粉末 4 份分別置于 300 mL 錐形瓶中, 分別加入 100 mL 的蒸餾水、40 %乙醇、70 %乙醇和 無水乙醇,在 65 ℃下超聲輔助提取 30 min,超聲功率 為 320 W。冷卻離心,導(dǎo)出上清液,將濾渣重復(fù)提取 2 次。合并濾液,抽濾,濃縮至 200 mL,用提取劑定容至 250 mL。
1.3.2 抗氧化能力測(cè)定
向比色管中加入0.30、0.60、0.90、1.20、1.50、1.80、2.10、 2.40、2.70、3.00 mL 的地皮菜提取液,加蒸餾水至 3.00 mL, 依 次 加 6 mmol/L FeSO4 溶 液 2.00 mL,2.4 mmol/L 的 H2O2 溶液 2.00 mL,搖勻,靜置 10 min,加入 6 mmol/L 水楊酸溶液 2.00 mL,搖勻,37 ℃水浴 30 min,離心 (3 000 r/min)10 min。取上清液于 520 nm 測(cè)吸光度 (A),以蒸餾水代替水楊酸做參比調(diào) i 零(A)j 。以蒸餾水 代替樣品液做空白對(duì)照(A0 ),平行測(cè)定 3 次。吸取 1.00 mL 150 μmol/LNBT,1.00 mL 60 μmol/L PMS 于比色管中,分別加入 0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、 1.20、1.40、1.60、1.80、2.00 mL 樣品液,補(bǔ)加蒸餾水 至 4.00 mL,混勻,加入 1.00 mL 468 μmol/L NADH(由 16 mmol/L Tris-HCl 在 pH 8 時(shí)配制而成)。于 560 nm處 測(cè)定樣品吸光度(A),以蒸餾水代替 i PMS 溶液做參比 參比調(diào)零(A)j 。以蒸餾水代替樣品液做樣品空白對(duì)照 (A0 ),平行測(cè)定 3 次。將 5.00 mL 7 mmol/L 的 ABTS 和 88 μL 140 mmol/L 的過硫酸鉀混合,在 25 ℃、避光的條件下靜置過夜,形 成 ABTS+ ·儲(chǔ)備液,使用前用無水乙醇稀釋成工作液。 在 734 nm 波長(zhǎng)下的吸光度為 0.7±0.02。吸取 0.04、 0.08、0.12、0.16、0.20、0.24、0.28、0.32、0.36、0.40 mL 地 皮菜提取液于比色管中,加蒸餾水至 0.40 mL。加入 2.00 mL ABTS·+ ,振蕩 30 s,25 ℃下靜置 6 min。在 734 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定地皮菜提取液樣品的吸光度值 (A),以 i 80 %乙醇溶液代替 ABTS+ ·溶液做參比調(diào)零(A)j 。以蒸 餾水代替樣品液做樣品空白對(duì)照(A0 ),平行測(cè)定 3 次。
2 結(jié)果與分析
OH 是目前所知活性氧中對(duì)生物體毒性最強(qiáng),危 害最大的一種自由基,可與生物體內(nèi)多種分子作用, 造成糖類、氨基酸、蛋白質(zhì)、核酸等物質(zhì)氧化損傷,使細(xì) 胞壞死或突變。因此·OH 清除率是反映藥物抗氧 化作用的重要指標(biāo)。地皮菜提取液清除羥基自由基能 力見圖 1。
4 種地皮菜提取液都具有不同程度 的清除 DPPH·能力,且清除能力與提取液用量呈正相 關(guān)。當(dāng)提取液用量較小時(shí),4 種提取液清除能力接近。 但隨著提取液用量的增加,水提取液和 40 %乙醇提取 液清除 DPPH·能力顯著增加,明顯優(yōu)于 70 %乙醇和 無水乙醇提取液。當(dāng)提取液用量為 3.00 mL 時(shí),水提取 液、40 %乙醇提取液、70 %乙醇提取液和無水乙醇提 取液對(duì) DPPH·的清除率分別為:96.73 %、87.52 %、 72.07 %、52.23 %。
3 結(jié)論
地皮菜不同提取液均具有明顯的清除羥基自由 基、超氧陰離子自由基、DPPH·和 ABTS+ ·作用和還原 能力。其清除作用和還原能力與提取液用量呈正相 關(guān)。地皮菜水提取液清除 4 種自由基作用和還原能力 最強(qiáng),無水乙醇提取液的清除作用和還原能力最弱。 抑菌作用分析表明地皮菜水提液對(duì)金黃色葡萄球菌、 枯草芽孢桿菌的具有良好的抑制作用,而無水乙醇提 取液對(duì)大腸桿菌的抑制作用最強(qiáng)。
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