腸道菌群在糖苷類(lèi)化合物的代謝過(guò)程中起著 重要作用，目前植物中多數(shù)多酚類(lèi)化合物以苷類(lèi)的 形態(tài)存在，口服后經(jīng)過(guò)水解被吸收，這個(gè)過(guò)程發(fā) 生在大腸或者小腸，研究資料表明在結(jié)腸的菌群具 有強(qiáng)大的催化和水解潛力，它們能夠催化黃酮類(lèi)化 合物的骨架 C6-C3-C6 斷裂為各種酚酸類(lèi)代謝產(chǎn) 物，大多數(shù)糖苷類(lèi)化合物需經(jīng)腸道菌群酶解為苷 元等代謝產(chǎn)物而發(fā)揮藥效。

1 實(shí)驗(yàn)儀器與材料

Agilent 1100 LC-DAD 系統(tǒng)（包括在線脫氣機(jī)、 低壓四元梯度泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、二極管陣列 檢測(cè)器和色譜工作站）；FA1004 萬(wàn)分之一天平（上 海精密科學(xué)儀器有限公司）；JSP-500A 型高速多功 能粉碎機(jī)（浙江省永康市金穗機(jī)械制造廠）；昆山舒美KQ250DB 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。三氣培養(yǎng)箱（德國(guó) BINDER；CB150）。 射 干 苷（批 號(hào) 為 111632-200501，購(gòu) 于 中 國(guó) 食 品藥品檢定研究院）；野鳶尾苷和野鳶尾黃素（批號(hào)分別為13030803、13051402，均購(gòu)于成都普瑞法科 技有限公司）；鳶尾黃素（批號(hào)為12081808，購(gòu)于成都 生物科技有限公司）。射干藥材采于湖北GAP基地， 經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)李峰教授鑒定為射干Belamcanda chinensis（L.）DC.的根及根莖。乙腈為色譜純；水為 娃哈哈純凈水；乙醇、磷酸等其他試劑均為分析純。 K2HPO4·3H2O，KH2PO4，NaCl，（NH4）2SO4， MgSO4·7H2O，CaCl2，Na2CO3，L- 半胱氨酸，L- 抗壞 血酸，牛肉膏，蛋白胨，營(yíng)養(yǎng)瓊脂等均購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán) 化學(xué)試劑集團(tuán)公司。 大鼠，雄性，體質(zhì)量 180~220 g，由遼寧長(zhǎng)生生 物技術(shù)有限公司提供，動(dòng)物許可證號(hào) SCXK（遼） 2010-0001。

2 方法與結(jié)果

2.1 厭氧培養(yǎng)液的制備

溶液 A：稱(chēng)取 K2HPO4·3H2O 1.02 g 加水適量使 溶解并稀釋至 100 mL，備用。溶液 B：稱(chēng)取 KH2PO4 0.47 g，NaCl 1.18 g，（NH4）2SO4 1.21 g，MgSO4·7H2O 0.51 g，CaCl2 0.12 g，加水適量使溶解并稀釋至 100 mL，備用。溶液 C：稱(chēng)取 Na2CO3 12 g 加水適量使溶 解并稀釋至 150 mL，備用。分別取 A 液 37.5 mL、B 液 37.5 mL、C 液 50 mL 混合，加入 L- 半胱氨酸 0.5 g， 25% L- 抗壞血酸 2 mL，牛肉膏 1 g，蛋白胨 1 g，營(yíng)養(yǎng) 瓊脂 1 g，加蒸餾水至 1 L，鹽酸調(diào) pH 至 7.5~8.0，即 可。

2.2 大鼠腸道菌培養(yǎng)液的制備

按 1 g∶4 mL 的質(zhì)量體積比將大鼠新鮮糞便 與生理鹽水混合研磨制成懸濁液，低溫離心 15 min （5000 r·min-1）后得上清液，即為腸道菌液。取 50 mL 腸道菌液，加入 500 mL 培養(yǎng)液中，混勻，得到 培養(yǎng)液，將厭氧培養(yǎng)液置于三氣培養(yǎng)箱中 37 ℃厭氧 條件下（NO2∶CO2∶O2=78∶20∶2）培養(yǎng) 24 h，得到 培養(yǎng)液（1）；另取 200 mL 培養(yǎng)液在 0.08 MPa、115 ℃ 條件下滅菌 20 min，得到空白培養(yǎng)液（2）。

2.3 大鼠腸道菌對(duì)射干飲片中射干苷、野鳶尾苷代謝轉(zhuǎn)化作用

取射干飲片 50 g，平行 3 份，每份分別加入 100 mL 大鼠腸道菌培養(yǎng)液（1），混合后在三氣培養(yǎng) 箱厭氧條件下（NO2∶CO2∶O2=78∶20∶2）37 ℃培養(yǎng) 24 h，取出，用水洗滌飲片，80 ℃干燥至干，粉碎，備 用。

2.4 HPLC方法的建立

2.4.1 色譜條件

色譜柱為 Column XB-C18（4.6 mm × 250 mm， 5 μm）；流動(dòng)相為 0.2% 磷酸水溶液（A）和乙腈（B）， 梯度洗脫：0~15 min，A 為 85%~75%；15~25 min，A 為75%~72%；25~35 min，A為72%~65%；35~50 min， A 為 65%~50%。體積流量為 1.0 mL·min-1；DAD 檢 測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)為 265 nm；柱溫 30 ℃。

2.4.2 專(zhuān)屬性實(shí)驗(yàn)

在“2.4.1”色譜條件下，測(cè)定空白培養(yǎng)液（A）， 空白培養(yǎng)液 + 混合對(duì)照品（B）、射干飲片（C）和射干 飲片孵育 24 h（D）的色譜圖，見(jiàn)圖 1。結(jié)果表明：在 此色譜條件下，樣品溶液中射干苷、野鳶尾苷、鳶尾 黃素及野鳶尾黃素色譜峰可完全分離，培養(yǎng)液中其 他組分無(wú)干擾，專(zhuān)屬性良好。

2.4.3 線性關(guān)系考察

精密稱(chēng)取射干苷、野鳶尾苷、鳶尾黃素、野鳶尾 黃素對(duì)照品各適量，加 70% 乙醇溶解，分別制成各 對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。再分別精密吸取各對(duì)照品儲(chǔ)備溶 液適量至量瓶中，用 70% 依次稀釋成不同質(zhì)量濃度 梯度的工作溶液，工作液中各成分的濃度見(jiàn)表 1。

3 討論

射干主要含射干苷、野鳶尾苷、鳶尾黃素、野鳶 尾黃素、次野鳶尾黃素、白射干素等異黃酮類(lèi)化合 物，具有抗炎、抑菌、抗病毒等多種藥理效應(yīng)，但由于 射干苷、野鳶尾苷等苷類(lèi)成分的分子量較大，脂溶性 較差，因此在體內(nèi)的吸收不好，生物利用度較低，有 德國(guó)學(xué)者研究報(bào)道，大鼠在口服射干苷溶液后，在 其尿液樣品中只檢出鳶尾黃素而并未發(fā)現(xiàn)射干苷。 說(shuō)明在體內(nèi)射干苷是通過(guò)脫掉糖基轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的苷 元鳶尾黃素而參與體內(nèi)生物活動(dòng)。在前期腸吸收研 究中，也發(fā)現(xiàn)射干苷及野鳶尾苷在大鼠腸道內(nèi)會(huì)水 解為鳶尾黃素及野鳶尾黃素，并且腸道LPH 酶可 能參與了射干苷及野鳶尾苷在腸道的水解過(guò)程。



 

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