豌豆(Pisum sativum)是我國重要的食用豆類之 一，是具有糧食、蔬菜、飼料和醫(yī)藥等多種用途的作 物?，F(xiàn)代藥理表明豌豆有增強機(jī)體免疫功能、防癌 治癌、通利大腸等作用，藥用價值顯著(崔再興, 李 玲, 2010)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豌豆(Pisum sativum)品種'成豌 8 號'，由四川省 農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供，2017 年收獲，研磨后置于-40 ℃ 冰箱中儲藏。所用化學(xué)試劑均為分析純，購自北京 廣達(dá)生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Hitachi S-3400N掃描電子顯微鏡(日本Hitachi 公司)；1093 CYCLOTEC 旋風(fēng)磨(瑞典 Foss 公司)； 全波長酶標(biāo)儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)； KQ-500E型超聲波清洗器(昆山舒美超聲儀器有限公司)；UV759CRT型紫外可見分光光度計(上海佑科 儀器公司)；SHZ-D (Ⅲ)型循環(huán)水式真空泵(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 (上海亞榮生化儀器廠)。

1.3 方法

1.3.1 豌豆粗多糖的提取

豌豆利用自來水浸泡6 h后手工去皮，在 70 ℃ 條件下干燥過夜，然后研磨并過 80 目篩。豌豆粉 末加入 95% 乙醇(1∶30, W/V)在 23 ℃下提取 24 h，以除去脂肪、色素以及小分子雜質(zhì)。利用裝有布氏 漏斗的抽濾瓶連接循環(huán)水真空泵進(jìn)行減壓抽濾，濾 渣依次用95%的乙醇、無水乙醇、丙酮以及石油醚 清洗后風(fēng)干，得到預(yù)處理的豌豆粉末。參照 Li 和 Shah(2016; 2014)的方法稍作修改，取預(yù)處理豌豆 粉置于95.0 ℃熱水(1∶30, W/V)，150 W 超聲提取3 h，離心得到上清液；殘渣重復(fù)以上操作 1~2 次，利 用 RE-52AA 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，80 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮， 除去水分。用三倍體積的80%乙醇在4 ℃沉淀24 h；10 000 r/min，離心10 min，分離獲得下層白色沉 淀，冷凍干燥，得到粗多糖(crude polysaccharides of pea, CPP)。

1.3.2 測定多糖含量

采用硫酸苯酚法(Dubois et al., 1956; Imjongjairak et al., 2016)測定豌豆多糖含量。多糖被濃硫 酸水解為單糖，產(chǎn)生的單糖與苯酚結(jié)合生成有色物 質(zhì)，于 490 nm 下有最大吸收峰。利用吸光值與糖 含量的線性關(guān)系，對多糖進(jìn)行定量測定。配制濃度 為 0.1 mg/mL 的葡萄糖溶液，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到 回歸方程：Y=14.994X–0.0304 (R2 =0.9997)。

1.3.3 粗多糖的脫蛋白處理

參考Peng等(2016)的方法，略加修改。粗多糖 水溶液中加入一定比例(1/3~1/4)的 Sevag 試劑(正 丁醇∶氯仿=1∶5~1∶4)。劇烈振蕩反應(yīng)一段時間(20 min)，然后離心15 min (6500 r/min)。離心后，除去 有機(jī)層和水層交界處變性的蛋白質(zhì)，收集上層清 液。重復(fù)上述操作若干次，以盡可能地除去粗多糖 中所含的粗蛋白。收集水層并濃縮，以95%乙醇沉 淀，離心(3000 r/min, 20 min)沉淀物，以無水乙醇洗 滌，冷凍干燥，即可得到脫蛋白處理的豌豆脫蛋白 多糖(deproteinization of polysaccharides, TPP)。

1.3.4 超濾

采用截留分子量為 5 kD 的中空纖維超濾膜 3個組件聯(lián)用的辦法，豌豆粗多糖提取液在室溫、壓 力0.2 MPa條件下進(jìn)行連續(xù)超濾處理，至濃縮多糖 截留液為原體積的 1/5。冷凍干燥，樣品放置 4 ℃ 冰箱中保存。

2 結(jié)果與分析

利用超聲輔助提取豌豆可溶性多糖，粗多糖得 率為7.26%；豌豆中淀粉、蛋白占比較多，所以可溶 性多糖的得率較低。粗多糖通過脫蛋白處理，多糖 保留率為 87.45%；隨著蛋白的脫出會流失一部分 蛋白多糖，并且會破壞多糖，使得多糖有一定的損 失率。脫蛋白后的多糖進(jìn)行水洗脫和NaCl洗脫， 依次過離子交換柱與葡聚糖凝膠柱，分別得到WDEPP (13.92%)、N - DEPP1 (22.75%)、N - DEPP2 (2.03%)、W - DE - GPP - a (38.91%)、W - DE - GPP - b (17.53%)、N-DE-GPP1-a (35.28%)、N-DE-GPP1-b (6.39%)(圖1)。

觀察粗多糖(CPP)掃描電鏡圖中代表性的多糖 結(jié)構(gòu)。當(dāng) CPP 被放大 100 倍時，表面呈現(xiàn)光滑、不 規(guī)則的薄片狀結(jié)構(gòu)；鎖定片狀結(jié)構(gòu)，將CPP放大到 1 000倍時，多糖碎片表面略微凹凸不平，有孔洞； 放大到10 000倍，CPP表現(xiàn)平整、致密的平面結(jié)構(gòu)，最后低倍鏡下觀察到的孔洞呈干裂破損狀。

3 討論

掃描電鏡通過電子槍發(fā)射出電子束，在加速電 壓作用下，電子檢測器捕獲樣品室中樣品表面的電子信號形成圖像(Martin et al., 2006; Holbrook et al., 2006)。近年來，隨著掃描電鏡技術(shù)的普及和應(yīng) 用，掃描電鏡對大分子顆粒超微形貌的觀察，成為 全面分析大分子結(jié)構(gòu)特性必不可少的一種輔助研 究手段(王紹清等, 2011)。另外，掃描電子顯微鏡在 對多糖等生物大分子表面形貌的觀察研究中得到 越來越多的應(yīng)用(Sun et al., 2017)。本研究對從豌 豆中提取的粗多糖依次進(jìn)行不同純化處理，通過掃 描電鏡觀察多糖顆粒結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)其表現(xiàn)出明顯的微 觀形態(tài)變化及特征規(guī)律，隨著多糖組分的一步步純 化，其宏觀顆粒逐漸細(xì)化變小，而微觀結(jié)構(gòu)基本保 持致密穩(wěn)定的狀態(tài)。