急進(jìn)高原后急性高山病( AMS) 的發(fā)病率居高 不下，其中高原心臟疾病是很重要的一部分。文 獻(xiàn)報道，高原環(huán)境運(yùn)動者 30% 的死亡與高原心臟病 猝死相關(guān)。高原心臟病的發(fā)生發(fā)展比較復(fù)雜， 尤其對急進(jìn)高原后心臟的影響還不甚清楚。前 期實(shí)驗(yàn)中，我們應(yīng)用低氧實(shí)驗(yàn)艙模擬海拔 7000 m 高 原環(huán)境，應(yīng)用超聲心動圖評估了 SD 大鼠在急進(jìn)高 原后不同時間點(diǎn)( 3 d、7 d、14 d、28 d) 心臟結(jié)構(gòu)和功 能變化，HE 染色病理切片評估了心肌組織病理變 化。發(fā)現(xiàn)急性高原低氧可造成大鼠心肌組織水腫， 心臟收縮和舒張功能嚴(yán)重受損。急進(jìn)高原第 7 天時 大鼠心臟收縮功能受損最嚴(yán)重。目前國內(nèi)外對 于 AMS 發(fā)生機(jī)制尚不十分明確，還沒有非常有效的 干預(yù)策略。雖然很多研究已證實(shí)炎性因子、氧化應(yīng) 激等在急性高原病發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用， 但均不足以從基因水平全面闡述急性高原病發(fā)生機(jī) 制，也不足以篩選新的防治急性高原病的藥物。本 研究擬通過低壓氧艙模擬高原低氧環(huán)境，建立急性 高原病大鼠動物模型。通過對高原低氧暴露 7 d 大 鼠心肌組織進(jìn)行全轉(zhuǎn)錄組測序，篩選與急性高原病 相關(guān)的差異表達(dá)基因。應(yīng)用 Connectivity Map 數(shù)據(jù) 庫對差異表達(dá)基因進(jìn)行分析比對，通過生物信息學(xué) 方法篩選潛在的防治急性高原病的藥物。

選取 6 周齡 SPF 級 SD 大鼠，體質(zhì)量( 200 ± 20) g，雄性，由昆山超聲儀器有限公司提供。許 可 證 號: SCXK ( 京) 2016-0006。所有動物實(shí)驗(yàn)均通過倫理委員會審核。 采用隨機(jī)數(shù)字表法將 SD 大鼠分為高原低壓低氧實(shí) 驗(yàn)組( HH 組) 、常壓常氧對照組( con 組) 、藥物干預(yù) 組( Sb203580 組) 。每組 20 只動物。

應(yīng)用實(shí)驗(yàn)艙(貴州風(fēng)雷航空軍械有限責(zé)任公司) 模擬高原低氧條件。實(shí) 驗(yàn)艙參數(shù)設(shè)定: 模擬海拔高度7000 m，升降速度 10 m / s，艙內(nèi)壓力 39． 1 kPa，艙內(nèi)氧氣壓力 9． 022 kPa。 實(shí)驗(yàn)組和藥物干預(yù)組大鼠均置于實(shí)驗(yàn)艙內(nèi)。實(shí)驗(yàn)艙 運(yùn)行時間 23 h / d，晝夜比 12 h∶ 12 h。每日上午開 倉 1 h 更換墊料、飼料、飲用水。藥物干預(yù)組大鼠于 每天開倉時腹腔注射 SB203580 溶液 ( 10 mg / kg) ， 每日注射 1 次，每只大鼠連續(xù)注射 7 d。對照組大鼠 置于實(shí)驗(yàn)艙外，處理等同于實(shí)驗(yàn)組大鼠。

ＲNA 提取 各組大鼠飼養(yǎng) 7 d 后處死，開胸取出心臟。應(yīng)用 Trizol 試劑提取心 肌組織總 ＲNA。取 100 mg 心肌組織樣品，加入 1 mL ＲNAstore 樣本保存液。按照 Trizol 試劑說明書， 一步法提取心肌組織總 ＲNA。采用 ＲNeasy Mini Kit 純化總 ＲNA，應(yīng)用 NanoDrop2000 分光光度計分別 測量 ＲNA 在波長為 260 nm、280 nm 的吸收值，間接 計算出提取的 ＲNA 濃度。使用 2% 瓊脂糖凝膠電 泳檢測 ＲNA 純度和完整性。

mＲNA 高通量測序 質(zhì)檢合格的 ＲNA 進(jìn)行文庫構(gòu)建。使用 HiSeq2500 進(jìn)行全 轉(zhuǎn)錄組高通量測序( 實(shí)驗(yàn)組和對照組各 6 只動物) ， 獲得 mＲNA 表達(dá)譜。使用 FastQC 對原始序列進(jìn)行 檢測，保留高質(zhì)量的整潔序列( clean reads) 。使用 Cufflinks 2． 0 對所有轉(zhuǎn)錄組結(jié)果進(jìn)行匯總整合，并 使用 Ensemble 轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)庫對獲得的結(jié)果進(jìn)行注 釋。使用 Cufflinks 軟件篩選差異基因。差異基因的 篩選標(biāo)準(zhǔn)為同時滿足以下條件: ①在兩個樣本中測 序讀數(shù)之和》10 的基因; ②滿足│log2 ( FC) │ ＞ 1 ( 上調(diào) 2 倍或下調(diào) 2 倍) ; ③同時滿足 P ＜ 0． 05 和 FDＲ( false discovery rate) ＜ 0． 05。高通量測序檢測 由北京博奧公司完成。

GO 分類和 Pathway 分析 應(yīng)用 SAM 軟件篩選出實(shí)驗(yàn)組和對照組比較，相對表達(dá)超 過 2 倍的差異基因。應(yīng)用可視化和整合發(fā)現(xiàn)的數(shù)據(jù) 庫( DAVID ) 軟件對差異基因功能進(jìn)行基因本體 ( GO) 分類、生物學(xué)通路( Pathway) 分析、功能注釋聚 類分析，獲得差異基因相關(guān)功能的功能富集類。

藥物數(shù)據(jù)庫篩選與高原低 氧作用機(jī)制拮抗的藥物 應(yīng)用生物信息學(xué)工具 ConnectivityMap 數(shù)據(jù)庫，整合差異表達(dá) mＲNA 信息， 推測高原低氧相關(guān)心肌損傷中差異表達(dá)基因與藥物 小分子功 能 的 關(guān) 系。將 比 對 系 數(shù) OＲ ＜ 1 且 P ＜ 0． 05的藥物定義為具有防治急性高原病的效應(yīng)。

各組動物完成實(shí)驗(yàn) 處死后，剖開胸腔，無菌條件下取出心臟。4 ℃ PBS 溶液漂洗，濾紙吸干。用電子天平稱量心臟濕質(zhì)量 后，置于 80 ℃恒溫干燥箱烘干 48 h 至恒質(zhì)量，稱重 心臟干質(zhì)量。計算組織含水量 = ( 濕重 － 干重) /濕 重 × 100% 。

各組動物完成實(shí)驗(yàn) 處死后，剖開胸腔，無菌條件下取出心臟。4 ℃ PBS 溶液漂洗，濾紙吸干。組織用 40 mL /L 多聚甲醛溶 液固定 24 h，常規(guī)脫水，石蠟包埋，連續(xù)切 5 片，片厚 約 4 μm，HE 染色，中性樹膠封片，光鏡下觀察心肌 組織病理學(xué)變化。

AQP1 mＲNA 檢測 應(yīng)用 real time PCＲ 技術(shù)檢測心肌組織 AQP1 mＲNA 表達(dá)。通過 Ｒeverse Transcription Kit 試劑盒將心肌組織 ＲNA 逆 轉(zhuǎn)錄為 cDNA，使用熒光定量 PCＲ 試劑盒進(jìn)行 AQP1 mＲNA 相對表達(dá)水平測定。檢測總體系為 25 μL ( 其中上下游引物各 0． 5 μL、Premix 12． 5 μL，cDNA 模板 2 μL、ddH2O 9． 5 μL) 。PCＲ 程序參照試劑盒中提供的兩步法檢測: 95 ℃ 30 s，95℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共 40 個循環(huán)。各組實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù) 3 次。以 β-actin 作為內(nèi)參基因，采用 2-ΔΔCt法計算 mＲNA 相對表 達(dá)量，引物由上海生工合成。AQP1 上游引物為 5’- GCCAGCGAGTTCAAGAAG-3’，下 游 引 物 5 ’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’。β-actin 上游引物為 5 ＇-TTCGCGGGCGACGATGC-3 ＇，下 游 引 物 為 5 ＇- CGAAGTCCAGGGCGAC-3＇。

采用 SPSS 16． 0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行 分析。計量資料以 x ± s 表示，進(jìn)行正態(tài)分布和方差 齊性檢驗(yàn)。多組間比較采用單因素方差分析，兩組 間差異采用獨(dú)立樣本 t 檢驗(yàn)。P ＜ 0． 05 為差異有統(tǒng) 計學(xué)意義。

將相對表達(dá)量 比值在 2 倍以上，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義( P ＜ 0． 05) 的 mＲNA 作為差異表達(dá) mＲNA。與對照組比較，高 原低氧實(shí)驗(yàn)組大鼠心肌組織中 1 084 個 mＲNA 表達(dá) 發(fā)生顯著變化。其中 457 個 mＲNA 表達(dá)上調(diào)，627 個 mＲNA 表達(dá)下調(diào) 。