漢松實(shí)為羅漢松科植物羅漢松 Podocarpus macrophyllus( Thunb． ) D． Don 和短葉羅漢松 Podocarpus macrophyllus( Thunb． ) D． Don var． maki Endl． 的 種 子 和 花托 。羅漢松實(shí)具有治心胃痛、血虛面色萎黃、大補(bǔ)元 氣的功效 ，主要含降二萜內(nèi)酯類及萜類化合物、生 物堿類化合物、黃酮類化合物及多糖類、氨基酸、礦 物元素和維生素等; 其提取物具有調(diào)節(jié)血脂、抗氧化、 保肝和抗腫瘤等藥理作用1。本課題組的前期研究 發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)于北海的羅漢松種子揮發(fā)油中含有大量的川芎 嗪，其在揮發(fā)油中的相對(duì)百分含量高達(dá) 97． 27%。本 研究中建立了羅漢松種子揮發(fā)油中川芎嗪的含量測定 方法，為建立羅漢松實(shí)藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1 儀器與試藥

1．1 儀器

Agilent1260 型 高 效 液 相 色 譜 儀( 美 國 Agilent 公 司) ; 電子天平，XS － 205DU 型天平( 瑞士梅特勒 － 托利 多儀器有限公司，十萬分之一) ; KQ － 500DB 數(shù)控超聲 波清洗器( 昆山舒美超聲儀器有限公司) ; CD － UPH － Ⅱ－ 20T 型超純水器( 成都超純科技有限公司) ; 萬能粉碎機(jī) ( 無錫久平儀器有限公司) 。

1．2 試藥

羅漢松種子鮮品采自廣西北海，經(jīng)廣西醫(yī)科大學(xué)藥 學(xué)院生藥學(xué)教研室李瓊講師鑒定為羅漢松科植物短葉 羅漢松 P． macrophyllus( Thunb． ) D． Don var． maki Endl． 的種子; 川芎嗪對(duì)照品( 上海雅吉生物科技有限公司，批號(hào) 為 16072405) ; 甲醇為色譜純，磷酸、石油醚( 30 ～ 60 ℃ ) 和無水硫酸鈉均為分析純，水為去離子水。

2 方法與結(jié)果

2．1 溶液制備

取川芎嗪對(duì)照品約 20 mg，精密稱定，加甲醇溶解 并定容于 25 mL 容量瓶中，得質(zhì)量濃度為 0． 757 2 g /L 的 對(duì)照品貯備液，精密移取 2． 0 mL，置 25 mL 容量瓶中， 用甲醇定容，搖勻，得質(zhì)量濃度為 0． 060 58 g / L 的川芎 嗪對(duì)照品溶液。取自然風(fēng)干的羅漢松種子，粉碎，過 20 目 篩，稱取 100 g 置圓底燒瓶中，加入 1 000 mL 蒸餾水浸泡 12 h 后，保持微沸蒸餾 6 h。餾出液用石油醚萃取 3 次， 每次 50 mL，合并醚層，加入無水硫酸鈉脫水，50 ℃ 減 壓 回 收 溶 劑 ，得 有 芳 香 氣 味 的 淡 黃 色 液 體 ，即 為 揮 發(fā) 油 ; 取 揮 發(fā) 油 約 100 mg，精 密 稱 定，加甲醇超聲溶 解 并 定 容 至 10 mL 容 量 瓶 中 ，用 0． 45 μm 微 孔 濾 膜濾過 ，取續(xù) 濾液 ，即得 供試 品溶 液。以 甲醇 為陰 性對(duì) 表 1 川芎嗪加樣回收試驗(yàn)結(jié)果( n = 6) 照溶液。

2．2 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱: GL Inertsil ODS － 3 C18 柱( 250 mm × 4． 6 mm， 5． 0 μm) ; 流動(dòng)相: 甲醇 － 0． 1% 磷酸溶液( 60 ∶ 40，V / V) ， 等度洗脫; 流速: 0． 8 mL / min; 檢測波長: 298 nm; 柱溫: 室溫; 進(jìn)樣量: 20 μL。分別精密吸取 2． 1 項(xiàng)下 3 種溶液 進(jìn)樣測定。在此色譜條件下，理論板數(shù)以川芎嗪峰計(jì)大 于 20 000，分離度大于 1． 5。色譜圖見圖 1。

2．3 方法學(xué)考察

線 性 關(guān) 系 考 察 : 精 密 吸 取 對(duì) 照 品 貯 備 液 0． 005， 0． 010，0． 020，0． 040，0． 050，0． 100，0． 200，0． 300 mL，分 別置 10 mL 容量瓶中，加甲醇稀釋，搖勻，定容，即得系 列對(duì)照品溶液。按 2． 2 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰 面積。以川芎嗪進(jìn)樣質(zhì)量濃度 ( X)為橫坐標(biāo)、相對(duì)應(yīng)的 峰面積 ( Y) 為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程 Y = 82． 182 X + 11． 538，r = 0． 999 8 ( n = 8 )。結(jié)果表明，川芎 嗪進(jìn)樣質(zhì)量濃度在 0． 38 ～ 22． 72 μg / mL 范圍內(nèi)與峰面 積線性關(guān)系良好。 精密度試驗(yàn): 取 2． 1 項(xiàng)下對(duì)照品溶液，按 2． 2 項(xiàng)下 色譜條件連續(xù)進(jìn)樣 6 次，測定川芎嗪的峰面積。結(jié)果的 ＲSD 為 0． 32% ( n = 6 )，表明儀器精密度良好。 重復(fù)性試驗(yàn): 取揮發(fā)油樣品 6 份，每份約 100 mg， 精密稱定，依法制備供試品溶液，并按 2． 2 項(xiàng)下色譜條 件 進(jìn) 樣 測 定。結(jié)果川芎嗪平均含量為 117． 17 μg / g， ＲSD 為 1． 60% ( n = 6 )，表明方法重復(fù)性良好。 穩(wěn)定性試驗(yàn): 取 2． 1 項(xiàng)下供試品溶液，室溫放置 0， 2，4，8，12，24 h 時(shí)，按 2． 2 項(xiàng)下色譜條件測定。結(jié)果的 ＲSD 為 0． 50% ( n = 6 )，表明供試品溶液在 24 h 內(nèi)穩(wěn)定。 加樣回收試驗(yàn): 取已知含量的揮發(fā)油 6 份，精密稱 定，分別置容量瓶中，各精密加入一定質(zhì)量的川芎嗪對(duì) 照品，按 2． 1 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按 2． 2 項(xiàng)下色 譜條件進(jìn)樣測定含量，計(jì)算回收率。結(jié)果見表 1。


3 討論

采用水蒸氣蒸餾法對(duì)羅漢松種子進(jìn)行提 取，得淡黃色的揮發(fā)油，提取率為 0． 18% 。在提取揮發(fā) 油的過程中發(fā)現(xiàn)，將種子浸泡一段時(shí)間再蒸餾，可提高 揮發(fā)油的提取率。考察了沸程為 30 ～ 60 ℃和 60 ～ 90 ℃ 石油醚對(duì)萃取效果的影響，結(jié)果 2 種石油醚的萃取效果 相當(dāng)。此外，萃取劑用量為被萃取液體積的 1 / 2，萃取次 數(shù) 3 次時(shí)，可獲得最佳萃取效果。 經(jīng)紫外掃描發(fā)現(xiàn)，川芎嗪在 298 nm 波長處有較強(qiáng) 吸收，故選擇 298 nm 作為測定波長。在加樣回收試驗(yàn) 中，對(duì)照品的加入量對(duì)測定結(jié)果的準(zhǔn)確性有影響。選擇 川芎嗪含量較高的揮發(fā)油樣品，加入較大量的對(duì)照品， 可獲得理想的測定結(jié)果。經(jīng)測定，產(chǎn)于北海的羅漢松種 子揮發(fā)油中川芎嗪含量為 117． 56 μg / g，種子中川芎嗪 的含量為 0． 212 μg / g。