血液病毒核酸檢測（nucleic acid testing，NAT） 直接檢測病毒核酸，與酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)相 比能縮短血液病毒檢測的窗口期， 更好地保障血 液安全， 已成為許多國家血液篩查病毒的必要手 段，目前我國也已全面開展血液病毒核酸檢測。標(biāo)本采集、處理、保存等因素對保證 NAT 檢測結(jié) 果的準(zhǔn)確性尤為重要。 若標(biāo)本采集、處理不當(dāng)可 能導(dǎo)致溶血，血漿中 Hb 可能會影響血液病毒核酸檢測的有效性和準(zhǔn)確性。

收集重慶市血液中心 2017 年 5 月-2017 年 7 月經(jīng)體檢和血液初篩檢驗合格 的無償獻(xiàn)血標(biāo)本 500 份，分別用含分離膠的“非可 替”抗凝真空管（含 EDTA-K2 噴霧干粉）采集 6~ 8ml 全血用于 NAT 檢測；“BD”抗凝真空采血管（含 EDTA-K2 噴霧干粉） 采集 4~5ml 全血用于 ELISA 檢測。 采集后的標(biāo)本管置于 4℃保存，在采集 4~6h 內(nèi) 2000g 離心 15min，檢測前置于 4℃保存，分別進(jìn) 行 ELISA 和 NAT。 挑選 ELISA 和 NAT 均為非反應(yīng) 性的標(biāo)本，封口膠密封后 4℃保存，1 周內(nèi)使用。 本 研究方案獲得重慶市血液中心倫理委員會的批 準(zhǔn)。

TEKEN RSP150/200 型全自動加樣 儀（瑞士 TEKEN 公司）和 FAME 2420/30 全自動酶 免 分 析 儀 （ 瑞 士 HAMILTON 公 司 ）、Procleix TIGRIS 全自動核酸檢測分析系統(tǒng) （西班牙蓋立復(fù) 公司）及配套的 PRI(試劑準(zhǔn)備溫育器，美國 Chiron 公司)、M-series AD 血細(xì)胞分析儀（瑞典 MEDONIC 公司）、RT3100 洗板機 （深圳雷杜公司）、EXL808 酶標(biāo)儀（美國 BIO-TEK 公司）、L535R 離心機（湖南湘儀公司）、KQ218 超聲波清洗器 （江蘇昆山市超聲波儀器有限公司）。

乙型肝炎病毒表面抗原診 斷試劑：北京萬泰、英國索林；丙型肝炎病毒抗體 診斷試劑：北京萬泰、美國強生；HIV（1+2）P24 抗 原及抗體診斷試劑：法國伯樂，HIV 抗體診斷試劑： 上?？迫A。

乙型肝炎病毒、 丙型肝炎病 毒、人類免疫缺陷 病 毒（1 型）NAT 試劑 盒（TMA化學(xué)發(fā)光法）”（Procleix Ultrio Plus Assay）， 美國Hologic 公司。 該試劑可同時定性檢測人類血漿中 的 HIV-1 RNA、HCV RNA 和 HBV DNA， 試劑盒 內(nèi)含有配套的 Procleix Plus HIV-1/HBV/HCV 鑒別 試劑。

HIV、HCV、HBV 的血漿病毒質(zhì) 控品（北京萬泰公司），均為有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，濃度分 別為：HIV 200IU/ml、HCV 30IU/ml、HBV 30IU/ml。

根據(jù)所用檢 測試劑說明書和參考類似研究，我們將本研 究的溶血程度分為 5 個梯度，血漿 Hb 濃度從低到 高依次為 0g/L（肉眼觀察無溶血）、5g/L、10g/L、20g/ L、40g/L。 因病毒載量過低時易出現(xiàn)檢測陰性，將難 以判定是溶血導(dǎo)致假陰性還是低病毒載量下檢出 率較低的影響， 所以本研究根據(jù)試劑說明書的檢 測下限和有關(guān)核酸檢測質(zhì)控品濃度設(shè)置的研究報 道，將病毒濃載量分為 2 個水平，低水平組：HIV 20IU/ml、HCV 10IU/ml、HBV 5IU/ml； 高 水 平 組 ： HIV 60IU/ml、HCV 20IU/ml、HBV 15IU/ml。

模型 將商品化的 HIV、HCV、HBV 核酸檢測血漿 病毒質(zhì)控品作為病毒標(biāo)準(zhǔn)品， 進(jìn)行稀釋建立梯度 病毒載量的標(biāo)本。 為避免基質(zhì)效應(yīng)，采用 NAT 和 ELISA 檢測均合格的無溶血血漿作為稀釋液，按實 驗設(shè)計的病毒載量水平對標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行稀釋。

取 NAT 和 ELISA 檢測均 合格的核酸標(biāo)本管中壓積紅細(xì)胞， 與等量去離子 水混勻后使用超聲波破碎紅細(xì)胞， 具體的超聲波 破碎紅細(xì)胞裝置， 采用去離子水煮沸 冷卻后制得的脫氣水作為聲傳導(dǎo)介質(zhì)。 具體操作 流程如下：超聲波作用 5min→顛倒混勻 10 次→超 聲波再次作用 5min→顛倒混勻 10 次→2000g 離心 15min→轉(zhuǎn)移上半部分液體到潔凈試管，作為溶血 標(biāo)本原液，血細(xì)胞分析儀檢測其 Hb 濃度。 用血細(xì) 胞分析儀測量離心后的溶血血漿 Hb 濃度，與已 知病毒載量的標(biāo)準(zhǔn)品混合， 通過經(jīng)檢驗合格的無 溶血血漿調(diào)節(jié)含病毒的溶血標(biāo)本體積， 配制成按 實驗設(shè)計的Hb 濃度和病毒載量。 溶血程度 Hb 為 40g/L 時的具體配比見表 1， 其余 Hb 梯度濃度的 配比按照設(shè)定的濃度計算，進(jìn)行配制。

根據(jù)試劑說明書， 每 次 NAT 檢測需 500μl 樣本，為確保樣本量的充足，本量水平組， 每種病毒 1 個， 用作研究測試的質(zhì)控 管；在每批次測試時，對每個 Hb 的梯度濃度級別， 均配制 1 個不含病毒的對照管， 因此每批的測試 標(biāo)本數(shù)為 80 個。 具體核酸檢測操作參見相關(guān)核酸 檢測研究文章。

本研究所建立的 Hb 梯 度濃度溶血模型中的 Hb 濃度，均在 95%的置信區(qū) 間范圍內(nèi)，P 值均大于 α，因此，每個 Hb 梯度內(nèi)各 標(biāo)本管的 Hb 濃度比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

本研究 3 個測試批次，每批次 80 個， 共計 240 個測試標(biāo)本。 Hb 分別為 0g/L、5g/ L、10g/L、20g/L、40g/L 的梯度濃度， 病毒載量分別 是 高 水 平 組 ：HIV 60IU/ml、HCV 20IU/ml、HBV 15IU/ml， 低 水 平 組 ：HIV 20IU/ml、HCV 10IU/ml、 HBV 5IU/ml，共 225 個測試標(biāo)本，均呈反應(yīng)性。 對 照管（未加病毒的測試標(biāo)本）均呈非反應(yīng)性。

目前在研究溶血對核酸檢測影響的報道中，采用的溶血方式多為反復(fù)凍融、機械破壞等， 這些方法耗時較長，雖能將紅細(xì)胞膜破壞，但也容 易導(dǎo)致 Hb 的變性。 在本研究中，利用超聲波的機 械效應(yīng)、空化效應(yīng)破碎紅細(xì)胞致紅細(xì)胞溶血，建立 溶血模型， 操作時間較短， 可提高研究實驗的效 率。 超聲波致紅細(xì)胞溶解的最佳條件需要的聲強 不高，因此利用超聲波清洗儀的超聲波能量，即 可對紅細(xì)胞進(jìn)行破壞釋放出其內(nèi)的血紅蛋白，制 得溶血標(biāo)本。 為保證超聲波的傳導(dǎo)效果，減少超聲 波由于空化機制在超聲波清洗儀容器內(nèi)液體中傳 導(dǎo)的能量耗損， 我們將去離子水通過煮沸后冷卻 的方式制成脫氣水，作為聲波傳導(dǎo)介質(zhì)，比單用 普通去離子水更利于聲能傳導(dǎo)， 進(jìn)一步提高了細(xì) 胞破碎效率。 而在制備溶血標(biāo)本原液時，由于超聲 波在全血中的聲能衰減比水中大， 為了減少不必 要的聲衰減，提高超聲破碎細(xì)胞的效能，同時為了 避免完全用壓積紅細(xì)胞破碎后形成的溶血標(biāo)本粘 度大而難以定量吸取的問題， 采用等量去離子水 稀釋混勻紅細(xì)胞后再用超聲波破碎。 充分破碎紅 細(xì)胞后離心，紅細(xì)胞碎片沉降到底部，但離心后標(biāo) 本溶血程度較重， 難以肉眼分辨細(xì)胞碎片和上層 液體的分界線， 為盡量避免在吸取溶血標(biāo)本原液 時吸入紅細(xì)胞碎片， 只吸取離心后的上半部分液 體。