中醫(yī)藥是中國(guó)傳統(tǒng)文化的寶貴財(cái)富和傳統(tǒng)醫(yī)學(xué) 的精華，中藥治療具有豐富的臨床經(jīng)驗(yàn)和獨(dú)特的理論體系，正逐漸受到國(guó)際社會(huì)越來(lái)越多的認(rèn)識(shí)和關(guān) 注，所以中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究是當(dāng)前研究的主要熱點(diǎn)， 把現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)應(yīng)用于中醫(yī)藥學(xué)領(lǐng)域，是中醫(yī)藥科 學(xué)化的必經(jīng)之路。

1 研究資料

1. 1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)雄性 SD 大鼠 20 只，購(gòu)自北 京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，合 格 證 號(hào): SCXK(京)2014 － 0004，體質(zhì)量 180 ～ 200 g，飼養(yǎng)于 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，常 規(guī)條件喂養(yǎng)，溫度 22 ℃，濕度 30% ～ 40% ，光照 12 h (8:00—20:00)，噪聲 ＜ 60 dB。

1. 2 藥品及試劑

柴胡疏肝散，方中各味中藥由首 都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院中藥房提供，經(jīng)中藥 專家鑒定符合《中國(guó)藥典》2005 版要求 。甲醇和乙 腈(HPLC 級(jí)，美國(guó) Fisher 公司)，其他試劑均為分析 純(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。實(shí)驗(yàn)用水為經(jīng) Milli － Q 凈化系統(tǒng)過(guò)濾的去離子水。

1. 3 主要儀器

Agilent 1290 UPLC － 6540 accurate mass Q － TOF 色譜 － 質(zhì)譜聯(lián)用儀，配置 MassHunter 質(zhì)譜工作站和 MPP 軟件 工 作 站( 美 國(guó) Agilent 公 司);CF16ＲXII 離心機(jī)(日本 Hitachi 公司);SAS 渦 旋混合器(英國(guó) Stuart 公司);KQ3200 超聲波清洗器 (昆山舒美超聲儀器有限公司);Milli － Q 超純水制備儀 (美國(guó) Millipore 公司);分析天平(瑞士 Mettler)。

1. 4 色譜條件

Water HSS T3 色譜柱(100 mm × 2． 1 mm，1． 8 μm);流動(dòng)相由 A 相(含 0． 1% 甲酸水 溶液)和 B 相(0． 1% 甲酸乙腈溶液)組成，梯度洗脫 程序:0 ～ 20 min，10% B→90% B;20 ～ 25 min，90% B;25 ～25． 1 min，90% B→10% B;25． 1 ～ 30 min，10% B。流速:0． 20 mL /min;柱溫:30 ℃;進(jìn)樣量 5 μL。

1. 5 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源(Dual ESI);霧化器(N2)壓力 40 ( psig);輔助氣(N2) 流速 10 L /min; Fragment 電 壓 175 V; 掃 描 質(zhì) 量 范 圍 M/Z 100 － 1700，掃描速度 1 specra /s，掃描模式為 full － mass 全掃描。正離子掃描毛細(xì)管電壓為 4． 0 kV，輔助器 溫度為 350 ℃ ;負(fù)離子掃描毛細(xì)管電壓為 3． 5 kV，輔 助器溫度為 320 ℃。

1. 6 柴胡疏肝散灌胃液制備方法

取處方量陳皮 12 g、柴胡 12 g，川芎 9 g、香附 9 g、枳殼 9 g、芍藥 9 g， 炙甘草 3 g，加 10 倍量水浸泡 1 h 后，煎煮 6 h，紗布 過(guò)濾，加入 8 倍量水煎煮 4 h，合并 2 次濾液，真空濃 縮干燥，得浸膏(1 g 浸膏相當(dāng)于原藥 1． 125 g)。稱 取適量，蒸餾水溶解，即得柴胡疏肝散灌胃藥液。

1. 7 血清樣品制備方法

含藥血清樣品制備:取同 批次雄性 SD 大鼠 10 只禁食不禁水 12 h，給予柴胡 疏肝散藥液 1． 5 mL /100 g 灌胃，給藥 2 h 后，10% 水 合氯醛麻醉大鼠，自大鼠眼眶后靜脈叢取血 2 mL 于 含抗凝劑 EP 管中，全血以 4 000 r/min 離心 15 min， 取血清樣品，用 4 倍體積冰冷的甲醇提取，12 000 r/ min 離去 10 min，去除蛋白質(zhì)以及較大的脂質(zhì)，取上 清液蒸發(fā)至干，重新溶于 50 μL 10% 乙腈水溶液中， 即得含藥血清。空白血清樣品制備:取同批次雄性 SD 大鼠 15 只禁食不禁水 12 h，給予與柴胡疏肝散 藥液相同體積的生理鹽水灌胃，其余處理方法同含 藥血清制備。

1. 8 入血成分分析方法

取含藥血清樣品、空白血 清樣品及柴胡疏肝散水煎劑樣品，行 UPLC － QTOF (儀器型號(hào) agilent 1290 － 6540)檢測(cè)，正負(fù)離子模式 各檢測(cè) 1 遍。采集的數(shù)據(jù)使用 MassHunter 質(zhì)譜工 作站和 MPP 軟件進(jìn)行分析，主要包括提取分子特 征、MPP 遞歸分析、通過(guò)離子查找化合物、MPP 軟件 差異分析 4 個(gè)步驟，建立 UPLC 色譜圖。通過(guò)對(duì)數(shù) 據(jù)的保留時(shí)間、精確質(zhì)量數(shù)進(jìn)行校準(zhǔn)、過(guò)濾，找出各 組不同樣品之間的差異成分。然后通過(guò)本實(shí)驗(yàn)室的 中藥成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)(TCM Database)對(duì)正離子模式、負(fù) 離子模式化合物進(jìn)行搜庫(kù)，找到中藥類化合物。對(duì)柴胡疏肝散藥材含有的化合物 成分進(jìn)行總結(jié)，找出其共有的成分，即為可能入血的 藥材成分。

2 結(jié) 果

入血成分為柴胡疏肝散水煎劑中及柴胡疏 肝散灌胃大鼠血清中均含有的成分，右上圓圈部分 為柴胡疏肝散藥材中采集到的化合物，左上圓圈部分為柴胡疏肝散灌胃大鼠血清中采集到的化合物， 而中下圓圈部分為空白組大鼠血清中采集到的化合 物，左上圓圈和右上圓圈的交集不包含中下圓圈交 集的部分即為可能的入血成分。

3 討 論

中藥復(fù)方組成復(fù)雜，各種組分物理化學(xué)性質(zhì)各 異，不同的制備方法(如溫度、pH 值等)、不同的產(chǎn) 地、不同時(shí)期采摘等都會(huì)影響中藥復(fù)方中有效成分 含量，甚至影響療效。用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)研究和發(fā)展 中藥，必須著眼于中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的研究。但傳 統(tǒng)方法如色譜、光譜等技術(shù)得到的藥物成分很可能 只是一般化學(xué)成分，或可能只是活性成分的前體物 質(zhì)，多數(shù)中藥或復(fù)方現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中測(cè)定的所謂 “有效成分”多為主要藥物的主要成分或指標(biāo)性成 分，并無(wú)充分依據(jù)證明其為有效成分。而UPLC法涵蓋了小顆粒填料、非常低系統(tǒng)體積及快速檢測(cè)手 段等全新技術(shù)，與高效液相色譜法(HPLC)相比，還 增加了分析的通量、靈敏度及色譜峰容量，具有分析 速度快、分離效率高、檢測(cè)靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，可通 過(guò)檢測(cè)分析不同配伍中藥加工過(guò)程中有效物質(zhì)成分 的變化及相互影響，較好地探索中藥復(fù)方配伍規(guī)律 及其作用機(jī)制。

 

免責(zé)聲明：文章僅供學(xué)習(xí)和交流，如涉及作品版權(quán)問(wèn)題需要我方刪除，請(qǐng)聯(lián)系我們，我們會(huì)在第一時(shí)間進(jìn)行處理。