歸柏化瘀膠囊由當(dāng)歸、黃柏、白芍、醋延胡索、甘草五味中藥 組成，具有活血化瘀、清利濕熱之功效，用于慢性非細(xì)菌性前列 腺炎血淤兼濕熱證，癥見尿頻，尿急，尿痛，尿道口常有少量黏 液，口苦，小便短黃。方中當(dāng)歸主要含有機(jī)酸類、香豆素類、黃酮 類成分，其中阿魏酸具有抗血小板聚集，抑制血小板 5- 羥色胺 釋放，抑制血小板血栓素的生成，增強(qiáng)前列腺素活性，鎮(zhèn)痛，緩 解血管痙攣等作用。黃柏主要含小檗堿、黃柏堿等生物堿類 成分，具有抗細(xì)菌、真菌、病毒及其他病原微生物的作用。白 芍主要含苷類、萜類、黃酮類、鞣質(zhì)類等，其主要有抗炎、抗菌、保 肝、鎮(zhèn)痛等 。

1 儀器和試藥

Agilent 1200 高 效 液 相 色 譜 儀，DAD 紫 外 檢 測 器，美 國 Agilent 公司；Mettler AE240 電子分析天平，瑞士 Mettler 公司； BSA224S-CW 型電子分析天平，德國 Sartorius 公司；Centrifuge 5415D 高速離心機(jī)；Milli-Q Academic 純水機(jī)，美國 Millipore 公 司；昆山舒美KQ-250DB 型超聲波清洗儀，昆山市超聲儀器有限公司。 歸柏化瘀膠囊（南京正大天晴制藥有限公司生產(chǎn)，批號：160401、160501、160601）；芍藥苷對照品（批 號：110736- 201704，含量以 94.9% 計(jì)）、阿魏酸對照品（批號：111787-201002 含量以 100% 計(jì)）均購自中國食品藥品檢定研究院。乙腈（色譜 純，美國天地公司），水為去離子水，其它試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為 Phenomenex Luna C18 色譜柱（4.6 mm×250 mm， 5 μm）；流動相：乙腈 - 0.1% 磷酸；流速：1.0 ml/min，梯度洗脫； 檢測波長：235 nm；柱溫：30℃ ；進(jìn)樣量 10 μl。

2.2. 對照品溶液制備

分別精密稱取芍藥苷和阿魏酸對照品適量，加 50% 甲醇制 成每 1 ml 含芍藥苷、阿魏酸分別為 120.0μg、20.0 μg 的混合對 照品溶液。

2.3 供試品溶液制備

取裝量差異項(xiàng)下的本品內(nèi)容物，混勻后，研細(xì)，取約 0.5 g， 精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入 50% 甲醇 25 ml，先稱定 重量，超聲處理（功率 250 W，頻率 40 kHz）30 min，待冷卻至室 溫后再次稱定重量，用 50% 甲醇補(bǔ)足減失的重量，混勻后濾過， 取續(xù)濾液，離心，作為供試品溶液。

2.4 定量限

按 2.1 項(xiàng)下上述色譜條件，取芍藥苷、阿魏酸對照品溶液， 逐級稀釋后，進(jìn)行試驗(yàn)， 結(jié)果芍藥苷、阿魏酸的定量限分別為 3.7ng （S/N ＝ 9.7），11.9 ng （S/N ＝ 10.5），檢測限分別為 0.42 ng （S/ N ＝ 3.2），0.33 ng （S/N ＝ 3.3）。

2.5 線性關(guān)系考察

精密稱取芍藥苷和阿魏酸對照品適量，制得每 1 ml 含芍 藥苷 1 042.4 μg、阿魏酸 125.6 μg 的混合溶液，依次精密量 取 混 合 對 照 品 溶 液 0.1、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 ml 于 5 ml 量 瓶 內(nèi)，加 50% 甲醇稀釋至刻度后，搖勻，注入液相色譜儀，測定， 以進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲 線，回歸方程分別為 Y ＝ 746.74X － 202.92，r ＝ 0.999 9；和 Y ＝ 6 246.4X － 610.91，r ＝ 0.999 9。芍藥苷、阿魏酸分別在 20.848 ～ 416.960 μg/ml 和 2.512 ～ 50.240μg/ml 范圍內(nèi)呈良 好的線性關(guān)系。

3 討論

3.1 檢測波長的選擇

為讓待測成分獲得較好分離度，且具較高的靈敏度，采用 DAD 檢測器，在 200 nm 至 400 nm 范圍內(nèi)掃描，選擇待測成分 最佳波長，最終選擇在 235 nm 檢測 2 個成分的含量。

3.2 色譜條件的確定

比 較 了 乙 腈 -0.1% 磷 酸、甲醇 - 水、乙腈 - 水三種流動 相系統(tǒng)，結(jié)果采用乙腈 - 0.1% 磷酸系統(tǒng)待測成分色譜峰峰形 較好，進(jìn)一步優(yōu)化洗脫條件，最終確定洗脫比例。進(jìn)而又考察 了 0.8 ml/min、1.0 ml/min、1.2 ml/min 不 同 流 速 和 25 ℃、30 ℃、 35℃不同柱溫對待測成分的影響，結(jié)果在流速 1.0 ml/min 及柱 溫 30℃時分離效果最佳。比較了 Phenomenex Gemini C18 柱、 Waters C18 柱及 Agilent Extend C18 柱，結(jié)果在本方法的色譜條件 下，各待測成分分離效果最佳，分離度均大于 1.5。

3.3 專屬性考察

采用 DAD 檢測器，分別對供試品中芍藥苷和阿魏酸進(jìn)行峰 純度驗(yàn)證，結(jié)果峰純度均符合規(guī)定。同時制備缺當(dāng)歸和白芍的 陰性供試品溶液，在芍藥苷和阿魏酸色譜峰位置無干擾峰，表明 所測定的芍藥苷和阿魏酸具有良好的專屬性。

3.4 供試品制備方法優(yōu)選

考察了乙醇、80% 乙醇、50% 乙醇、甲醇、80% 甲醇、及 50% 甲醇等不同提取溶劑對 2 個成分提取效果，結(jié)果采用 50% 甲醇 作為提取溶劑時 2 個成分提取率最佳，固選擇 50% 甲醇作為提取溶劑。

4 結(jié)論

本研究建立的歸柏化瘀膠囊中芍藥苷和阿魏酸含量測定測 定方法，能夠有效用于評價(jià)本品質(zhì)量。