枸杞為茄科植物寧夏枸杞 Lycium barbarum L． 的干燥成 熟果實，是我國傳統(tǒng)名貴藥材，具有調(diào)節(jié)免疫功能、保肝、 抗氧化損傷、抗腫瘤等藥理作用，一般認為與其所含枸 杞多糖、類胡蘿卜素和黃酮等活性成分相關。早期研究 主要針對枸杞多糖和黃酮類，近年來開始關注類胡蘿卜素 類，并發(fā)現(xiàn)其在人體內(nèi)的多種生物活性，作為 VA 的來源 治療皮膚角化癥、猝滅單線態(tài)氧、清除自由基、防止細胞 膜損傷、調(diào)控機體免疫應答等。目前，枸杞質(zhì)量標準未 對類胡蘿卜素類含有量進行限量要求，文獻也主要集中在 不同成熟度、加工方式枸杞中其含有量變化方面，但關于其指紋圖譜及不同產(chǎn)地聚類分析的研究較少。本實 驗從指紋圖譜和指標成分含有量測定 2 方面同時對枸杞質(zhì) 量進行定性和定量評價，旨在為藥材質(zhì)量的全面評價提供 參考依據(jù)。

Thermo Scientific Ultimate 3000 高效液相色譜儀 ( 美國賽默飛公司) ; KQ-400KDE 高功率數(shù)控超聲波清洗器 ( 昆山超聲儀器有限公司) ; Mettler AE240 電子分析天平 ( 十萬分之一，法國施耐德電器有限公司) ; Sartorius AG BS 電子分析天平 ( 萬分之一，法國施耐德電器有限公司) 。

二氯甲烷、正己烷、乙腈、甲醇 ( 色譜 級，美國 Fisher 公 司) ; 石 油 醚、丙 酮 ( 色 譜 純，德 國 Merck 公司) ; 甲醇、無水乙醇，分析純 ( 北京化工廠) ; 娃哈哈純凈水 ( 杭州娃哈哈集團有限公司) 。對照品玉米 黃素 ( 河南省標物生物科技有限公司，批號 170417，含有 量≥98%) 、β-胡蘿卜素 ( 河南省標物生物科技有限公司， 批號 170108，含有量≥98%) 、玉米黃素雙棕櫚酸酯 ( 上 海同田生物技術股份有限公司，批 號 144-67-2，含 有 量≥98%) 。

收集寧夏、甘肅、新疆、青海和內(nèi)蒙古 5 個產(chǎn) 地共 35 批枸杞樣品，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學劉春生教授鑒定鑒 定為茄科植物寧夏枸杞 Lyciumbarbarum L． 的干燥成熟果實。 信息見表 1。

2 方法與結(jié)果

2. 1 色譜條件

Diamonsil C18 色譜柱 ( 4. 6 mm× 250 mm， 5 μm) ; 流 動 相 乙 腈-甲 醇-正 己 烷-二 氯 甲 烷 ( 40 ∶ 15 ∶ 20 ∶ 20) ; 體 積 流 量 1 mL/min; 柱 溫 25 ℃ ; 檢 測 波 長450 nm; 進樣量 10 μL。

取玉米黃素、β-胡蘿卜素適量，分別 精密稱定 1. 04、2. 13 mg，加入二氯甲烷溶解后，流動相分 別定容于 10、100 mL 量瓶中; 取玉米黃素雙棕櫚酸酯適量， 精密稱定 9. 21 mg，加入玉米黃素、β-胡蘿卜素對照品溶液 各 1 mL 后，流動相定容于 5 mL 量瓶中，即得。玉米黃素、 β-胡蘿卜素、玉米黃素雙棕櫚酸酯質(zhì)量濃度分別為 20. 80 μg /mL、4. 26 μg /mL、1. 84 mg /mL。

提取方法參考陳敏報道并進行調(diào) 整。稱取 1 g 枸杞粉末，精密稱定，加入 0. 01% BHT ( 二 丁基羥基甲苯) ，15 mL 石油醚-丙酮 ( 2 ∶ 1) 混合溶劑常 溫提取 3 次至殘渣無色，每次 30 min，合并提取液，轉(zhuǎn)入 分液漏斗，蒸餾水洗去水溶性成分，石油醚層用無水硫酸 鈉干燥，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至干，石油醚定容至 25 mL，微孔 濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。提取過程避光。

精密吸取同一供試品溶液 10 μL，在 “2. 1”項色譜條件下連續(xù)進樣 6 次，以 1 號峰玉米黃素為 參照峰，得各共有峰相對保留時間 ＲSD 0. 44% ～ 2. 57%， 相對峰面積 ＲSD 0. 94% ～ 2. 84%，表明儀器精密度良好。

取同一批次枸杞粉末 6 份，制備供試 品溶液，精密吸取 10 μL，在 “2. 1”項色譜條件下進樣， 以 1 號峰玉米黃素為參照峰，各共有峰相對保留時間 ＲSD 1. 32% ～ 2. 93%，相對峰面積 ＲSD 1. 21% ～ 2. 85%，表明該 方法重復性良好。

取同一供試品溶液，在 “2. 1”項色 譜條件下于 0、2、4、8、12、24 h 進樣，各共有峰相對保 留時間 ＲSD 0. 98% ～ 2. 59%，相 對 峰 面 積 ＲSD 1. 41% ～ 2. 52%，表明供試品溶液在 24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

選取寧夏、甘肅、青海、新疆每個產(chǎn) 地各 3 批次枸杞藥材的 HPLC 圖，導入中藥指紋圖譜相似 度評價系統(tǒng)中，選擇中位數(shù)計算方法，確定最佳時間窗寬 度為 0. 1 min，采用多點校正，經(jīng)過色譜峰自動匹配，生成 對照圖譜，進行色譜峰整體相似性評價，見圖 1，不同產(chǎn) 地 12 批樣品 HPLC 色譜圖整體峰形一致，相似度 0. 924 ～ 0. 991，見表 2，表明不同產(chǎn)地枸杞化學成分相近，具有較 好的均一性。共標定 9 個共有峰，保留時間為 2. 01 min 處 的 1 號色譜峰響應較高，分離良好，故選作參照峰。

3 討論與結(jié)論

3. 1 條件選擇

枸杞中的類胡蘿卜素類成分主要包括類胡 蘿卜素和類胡蘿卜素酯兩大部分。本實驗首先對甲醇乙腈 ( 45 ∶ 55) 流動相體系進行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)甲醇-乙 腈體系無法洗脫出枸杞中的類胡蘿卜素酯類成分，這可能 是由于類胡蘿卜酯類成分極性太小的原因。通過向流動相 中添加一定比例的正己烷和二氯甲烷，可以有效地洗脫出 類胡蘿卜素酯類成分。值得注意的是，常規(guī)反相高效液相 色譜儀的在線脫氣裝置對正向溶劑的耐受性較差，本實驗 通過調(diào)整流動相流路，使流動相不經(jīng)過在線脫氣裝置直接 進入泵元件，避免了溶劑對儀器原件的損害。流動相在使 用前，需要提前混合均勻并超聲脫氣。

由于玉米黃素雙棕櫚酸脂色譜峰占總色譜 峰面積的 70%以上，給相似度計算帶來較大誤差，故進行 指紋圖譜相似度匹配時舍去此峰。不 同 產(chǎn) 地 12 批 樣 品 HPLC 色譜圖的整體峰形一致，相似度 0. 924～ 0. 991。利用 平均數(shù)法計算平均圖譜，作為 HPLC 對照指紋圖譜為枸杞 類胡蘿卜素類成分質(zhì)量評價的依據(jù)。此外，35 批樣品的聚 類分析表明，寧夏、青海枸杞聚為一類，表明 2 個產(chǎn)地枸 杞化學成分更為相近，具有較好的均一性。

含有量測定結(jié)果表明，不同產(chǎn)地枸杞中含有的化學成 分種類差異不大，但本實驗測定的 3 種成分含有量具有較 大差異，最高的為玉米黃素雙棕櫚酸酯 ( 21. 03 mg /mL) ， 以青海德令哈 ( S23、S18) 、寧夏中寧 ( S8) 較高; 其次 為玉米黃素 ( 0. 141 8 mg /mL) ，以寧夏中寧 ( S11) 、青海 德令哈 ( S24) 較高; β-胡蘿卜素最低 ( 0. 010 6 mg /mL) ， 以青海德令哈 ( S23、S24) 較高，這是由于玉米黃素和 β 胡蘿卜素為玉米黃素雙棕櫚酸酯的生物合成前體，隨著枸 杞的生長成熟，枸杞中玉米黃素雙棕櫚酸酯的含有量逐漸 增加，而且是類胡蘿卜素積累的主要形式，也是成熟枸杞 的特征類胡蘿卜素。因此，本實驗選擇該 3 種成分作為 枸杞質(zhì)量評價的指標。 此外，通過測定不同產(chǎn)地枸杞中類胡蘿卜素含有量發(fā)杞質(zhì)量更為相似，與聚類分析結(jié)果一致。

綜上所述，本研究建立枸杞 HPLC 指紋圖譜，并測定 3 種成分的含有量，該方法簡便準確，重復性好，可為該藥 材質(zhì)量控制提供參考。