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昆山舒美對樹莓葉黃酮提取的正交試驗

返回列表 來源:未知 發(fā)布日期:2019-07-17 08:55【

黃酮類化合物作為抗氧化作用顯著的一類天然產物,其可應用于心腦血管疾病、腫瘤、炎癥等治療, 樹莓葉黃酮同樣具有應用價值及研究意義。目前樹莓葉提取物的研究主要包括樹莓葉中水楊酸、鞣花酸和黃酮,其中已有研究表明,樹莓葉黃酮分離組分主要包括蘆 丁、檞皮素和山奈酚衍生物,故本研究擬采用乙醇浸提法從樹莓葉中提取蘆丁等黃酮類成分,采用紫外分光光度法對所含總黃酮進行了測定,以及通過建立 HPLC 完成了 樹莓葉黃酮的初步分離,從而完成了黃酮中蘆丁含量的準確測定,為樹莓葉研發(fā)蘆丁獸用中藥制劑提 供理論參考。


1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料和試劑


紅樹莓葉,采自寧夏某樹莓種 植園;蘆丁 標 準 品,購自北京索萊寶科技有限公司 ;甲 醇、乙 醇、石 油 醚、乙 酸 乙 酯、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉為分析純試劑。


1.1.2 儀器設備

高效液相色譜儀,美國 Waters公司產品;8453型紫外分光光度儀,美國 Agilent公 司 產 品;DFT-250 手 提 式 高 速 萬 能 粉 碎 機,溫嶺市林大機械有限公司產 品;電子分析天平(賽多利斯);恒 溫 水 浴 鍋 (DZKW-D-2型),北京市永光明醫(yī)療儀器廠產品;旋 轉蒸發(fā)儀,鞏義市予華儀器有限責任公司產品;KQ- 500型超聲波清洗器,昆山市超聲清洗儀器廠產品。


1.2 方法

1.2.1 總黃酮的提取


將樹莓葉經粉碎處理后,精 確稱重100g,加入乙醇加熱回流浸提后,取濾液經 石油醚、乙酸乙酯依次反復萃取,分離得最終乙酸乙 酯層棕紅色液體,經旋蒸儀蒸發(fā)至100mL,置4 ℃ 冰箱保存。將各粗提物 ?。保?mu;L 溶 解 于 甲 醇,并 定 容至10mL容量瓶,4 ℃保存?zhèn)溆谩?/span>


1.2.2 對照品溶液的制備

準確稱 取 蘆 丁 標 準 品 4.00mg,用甲醇定溶于10mL的棕色容量瓶中,充 分搖勻,得到蘆丁質量濃度為0.4mg/mL的標準品 溶液,用0.45μm 微孔濾膜過濾,4 ℃保存?zhèn)溆谩?/span>


1.2.3 紫外 分 光 光 度 法(UV)

采 用 亞 硝 酸 鈉-硝 酸鋁比色法,以蘆丁為標準品在510nm 處測定吸光 度,以吸光度(y)對各質量濃度(x)進行線性回歸, 得回歸方程y=32.6x-0.0049(R2=0.9992),線 性范圍0.002mg/mL~0.4mg/mL。


1.2.4 高效液相色譜

(HPLC)分離 利用反向色譜分離方法建立黃酮分離條件:AgilentZorBaxSB C18色譜柱(150mm×4.6mm,3.5μm),流動相為 1mg/mL乙酸-乙腈=72.5∶27.5,等度分離,柱溫 30 ℃,檢測波長:257nm;以蘆丁為標準品建立標準 曲線,以色譜峰面積(y)對各質量濃度(x)進行線性 回歸,得 回 歸 方 程 y=4E+06x+22119(R2 = 0.9993),線性范圍0.002g/mL~0.4g/mL。


1.2.5 單因素試驗設計

通過選擇料液比(A)、乙 醇濃度(B)、提取溫度(C)和提取時間(D)設計單因 素試驗設計(表1),考察各因素對黃酮提取率的影 響,每組試驗重復3次,取平均值。


1.2.6 正交試驗與響應面試驗設計

通過選擇料 液 比(A)、乙醇濃度(B)、提取溫度(C)和提取時間設計四因素三水平正交試驗和響應面設計試 驗,考察各因素對黃酮提取率的影響,每組試驗重復 3次,取平均值。





2 結果


測定結果 。 通 過 分 別 建 立 UV 和 HPLC色譜分離方法,對樹莓葉黃酮按照正交試驗和響應曲面試驗最佳工藝所得提取物,進行初步分 離,并對蘆丁含量進行準確測定和驗證,樹莓葉黃酮 中蘆丁實際含量為1.514mg/g,占總黃酮粗提物含 量的13.4%。


3 討論

樹莓葉作為紅樹莓果樹的副產物,而 黃 酮 作 為藥用植物中普遍存在的天然活性成分,且樹莓葉的黃酮類化合物含量高于果實,蘆丁作為槲皮素 的一種糖苷衍生物,槲皮素和蘆丁已被證實具有 抗腫瘤、保護心腦血管等多種生物學活性。 本試驗通過建立 HPLC色譜分離方法,對樹莓 葉黃酮按照正交試驗和響應曲面試驗最佳工藝所得提取物,進行初步分離,并對蘆丁含量進行準確測定 和驗證。本 試 驗 最 佳 工 藝 所 得 樹 莓 葉 黃 酮 提 取 率 1127 mg/100 g,顯 著 高 于 徐 雅 琴 等報 道 的 533.71mg/100g,樹莓葉蘆丁的純化及獸用中藥制 劑工藝仍需進一步研究和探索。