林蛙抗菌肽具有高效、光譜抗菌作用，不僅對化 膿菌、白色念珠菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、綠 膿桿菌等具有很強的抑制作用，對革蘭氏陽性菌、陰 性菌都有抑制作用，具有高效、廣譜抗菌的特點。 研究表明林蛙皮中的抗菌活性還具有一定的抗炎、鎮(zhèn) 痛作用，是極具開發(fā)研究前景的良好抗菌藥物。

1 實驗材料

1.1 實驗藥品與試劑

磷脂（北京美亞斯磷脂技術(shù)有 限公司），膽固醇（北京鼎國生物技術(shù)發(fā)展中心），磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、無水乙醇、冰醋酸等藥品 均為國產(chǎn)分析純。

1.2 實驗儀器

RE-52AA 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海雅榮生 化設(shè)備儀器有限公司），QL-991 Vortex（上海其林貝 爾儀器制造有限公司），昆山舒美KQ-250E 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），透皮吸收檢測儀（天津市 正通科技有限公司），電熱恒溫水浴鍋（上海精宏實 驗設(shè)備有限公司），Zetasizer 納米粒度電位儀（英國馬爾文儀器有限公司），微孔板分光光度計（美國伯 騰儀器有限公司），BP221S 電子天平（statorius）。

2 方法與結(jié)果

2.1 林蛙抗菌肽脂質(zhì)體的制備

采用薄膜分散法制備。初步稱取 30 mg 磷脂、10 mg 膽固醇、10 mg 林蛙抗菌肽并加入 5 mL 無水乙醇在 30℃水浴預(yù)熱后 在磁力攪拌器中充分溶解混勻，然后 35℃水浴下旋轉(zhuǎn) 蒸發(fā)將乙醇完全揮發(fā)，然后繼續(xù)抽濾直到燒瓶壁上有 一層均勻的薄膜；之后加入 20 mL 的 PBS（PH 6.8）繼 續(xù)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至瓶壁上的脂質(zhì)完全溶解，濃縮至 10 mL 的均一懸濁液，將混懸液于超聲儀上冰浴超聲 5 min 后于 4℃避光保存。

2.1.1 林蛙抗菌肽脂質(zhì)體的粒徑大小的測量

利用 Zetasizer 納米粒度電位儀測定脂質(zhì)體的粒徑。見圖 1。

林蛙抗菌肽脂質(zhì)體粒徑大小為 399.1 nm，脂質(zhì)體 大小合適，PDI 為 0.003<<0.1，說明采用薄膜分散法制 備的脂質(zhì)體大小分布均勻且大小合適。

2.1.2 脂質(zhì)體的形態(tài)

將制備的脂質(zhì)體通過掃描電鏡。 在掃描電鏡下的林蛙抗菌肽脂質(zhì)體形態(tài)均勻，分散度 較好，大小與 Zetasizer 納米粒度電位儀測量的結(jié)果基 本一致，見圖 2。

2.2 林蛙抗菌肽脂質(zhì)體包封率的測定

采用BCA法測 定包封率。精密稱取 4 mg BSA 標(biāo)準(zhǔn)品加入 1 mL 去離 子水配成 4 mg/mL 的母液，將母液稀釋成 2 mg/mL、 1 mg/mL、0.5 mg/mL、0.25 mg/mL、0.125 mg/mL、 0 mg/mL，利用酶標(biāo)儀在 562 nm 處測量比色，以牛血 清白蛋白含量為橫坐標(biāo)，以吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo) 準(zhǔn)曲線，得到直線回歸方程為Y = 0.3092 X+0.0071，R2 = 0.999 5，可信度較高。取 2.1 中制得的脂質(zhì)體在酶 標(biāo)儀中測量游離藥物的吸光度，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方 程計算游離藥物的含量。包封率 =（總藥量 - 游離藥 物量）/ 總藥量 ×100%。計算得包封率為 74.1%。

2.3 林蛙抗菌肽脂質(zhì)體處方篩選

以包封率為指標(biāo)， 利用單因素分析分別測定磷脂與膽固醇比例、林 蛙抗菌肽含量、磷酸緩沖液 PBS 的 pH 對包封率的影 響。

3 結(jié)論

本實驗通過單因素分析法考察了不同因素對林蛙 抗菌肽脂質(zhì)體包封率的影響以及對脂質(zhì)體處方的篩 選，得出林蛙抗菌肽脂質(zhì)體制備的最佳工藝為磷脂膽 固醇比為 4:1，藥脂比為 1:4，得到的包封率理論上為 79.20%。12 h 林蛙抗菌肽脂質(zhì)體在皮膚表面的存留率 為 91.79%，而其他林蛙抗菌肽產(chǎn)品的藥效時間基本在 4 h 左右，說明林蛙抗菌肽脂質(zhì)體緩釋效果較為明顯， 能有效的延長林蛙抗菌肽的藥效時間。本實驗對林蛙 抗菌肽脂質(zhì)體的研究對林蛙抗菌肽新劑型的開發(fā)具有 一定的實踐意義。



 

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