燈盞花主要產于云南、廣西、貴州 等地，又稱燈盞細心，為菊科植物短葶飛蓬的干燥全 草，其主要成分為黃酮類化合物，有效成分為燈盞花 乙素。具有清除活性氧自由基、溶解血栓、增強 腦部血液流動和降低血管阻力等作用，臨床上多用于治療心腦血管等疾病。作為國家重點開發(fā) 的中藥材，燈盞花在云南麗江、紅河等地實現(xiàn)大規(guī)模種植。

燈盞花藥材由云南易思高生物科技有限公司提 供; 燈盞花乙素對照品購自上海麥克林生化科技有 限公司; 乙醇、( NH4 ) 2 SO4、H3PO4、NaCl、Na2CO3、 Na2 SO4 Na3PO4 和 NaOH 均為分析純，甲醇為色譜 純、水為超純水。

KQ100DB 型超聲波清洗儀( 昆山市超聲儀器有 限公司) ; pH 計( 雷磁 PHS-3C) ; FA1004 型萬分之 一分析天平( 上海恒平科學儀器有限公司) ; HC3018Ｒ 高速冷凍離心機( 安徽中科中佳科學儀器有 限公司) ; 德國 IKA Lab Dancer 小舞靈漩渦混勻器。 Agilent 1260 高效液相色譜儀 ( 配備四元泵、 VWD 檢測器、自動進樣器、柱溫箱) ，色譜條件: Agilent TC-C18 色譜柱( 4． 6 mm × 150 mm，5 μm) ，流動 相為甲醇 － 0． 1 % 磷酸溶液( 40∶ 60) ，檢測波長為 335 nm，流速為 1 mL /min，柱溫箱為 25 ℃。

將干燥后的燈盞花 全草打粉至 80 目，取細粉 0． 1 g( 精密稱定) ，將其 置于 25 mL 具塞離心管中，加入 10 mL 甲醇，密塞， 稱重，超聲 1 h，放冷稱重，甲醇補足重量。然后于 4000 r/min 離心 10 min，取上清液，加水稀釋至 50 mL，作為燈盞花乙素粗提液。

考慮雙水相 體系的性質，選擇乙醇作為提取溶劑。取 10 mL 燈 盞花乙素粗提液至 15 mL 離心管中，加入一定量的 ( NH4 ) 2 SO4 和無水乙醇，調 pH 值至 6，渦旋 1 min， 使其充分混合。然后以4000 r/min 離心5 min，促使 其分相。下層即為鹽相，上層為乙醇萃取相。讀取 上下層體積之后( 相比 = 萃取相體積/水相體積) ， 用注射器移除下層水相。為防止萃取相中存在的鹽 對高效液相色譜儀造成腐蝕，萃取相中加甲醇 0． 5 mL 進行脫鹽處理，最后甲醇定容至 2 mL，過 0． 45 μm 有機相濾膜之后，取 10 μl 進 HPLC 進行分析。

采用 HPLC 法測定燈盞花粗提液中燈盞花乙素含量。根據燈盞花乙素 標準曲線計算其濃度，然后再按下式計算燈盞花乙 素含量( % ) :

Ｒ( % ) = (Cu × Vu / m) × 100

式中，Ｒ 為萃取效率( % ) ; Cu 為燈盞花乙素在萃取 相中的濃度( mg /mL) ; Vu 為萃取相的體積( mL) ; m 為稱取的燈盞花粉末的質量( mg) 。

所使用的乙醇能與水完全互溶，通過乙醇 － 水 體系統(tǒng)加入( NH4 ) 2 SO4，利用鹽析作用，促進乙醇與 水相的分離。雙水相體系的形成是( NH4 ) 2 SO4 與 乙醇爭奪水分子的過程，隨著鹽濃度的增大，鹽會奪 取水分子，促使乙醇從鹽相析出，使水分子離開乙醇 相，最終出現(xiàn)分相，上層為乙醇相，下層為鹽水相。 為研究不同條件下，雙水相體系中乙醇相的變化，通 過以下公式計算相比 Ｒv ∶ Ｒv = Vend ∶ Vin，式中，Vend為 乙醇相的體積，Vin為加入的乙醇的初始體積。當 Ｒv 趨近于 1 時表示乙醇與水完全分離。燈盞花乙素屬于黃酮類化合物，分子中含有多 個酚羥基和羰基，在 pH 較高和較低情況下，會發(fā)生 酚羥基氫離子的電離和羰基的質子化，最終變成大 極性離子。由于酚羥基的存在，燈盞花乙素相當于 多元弱酸，一般會以質子化陽離子形態(tài)、分子形態(tài)和 失質子化陰離子形態(tài)存在。根據相似相溶的原理， 弱極性的分子形態(tài)燈盞花乙素易富集于乙醇相中， 而大極性離子形態(tài)的燈盞花乙素則易于分配在水相 中。因此，溶液酸堿度對燈盞花乙素的分配起很重 要作用。分子形態(tài)的燈盞花乙素結構上的酚羥基和 羰基與乙醇羥基之間的氫鍵也非常有利于提高燈盞 花乙素的分配比，使其易富集于乙醇中。乙醇加入量為 1． 5 mL，保持其他實驗條件不 變，分別考察鹽質量分數(shù)為 5 % 、8 % 、10 % 、15 % 、 20 % 、25 % 和 30 % 時對萃取率的影響。在鹽質量分數(shù)小于 8 % 時，溶液無法形成雙水 相，當鹽質量分數(shù)大于 8 % 時，隨著鹽質量分數(shù)的增 加，萃取率逐漸增加，當( NH4 ) 2 SO4 質量分數(shù)為 25 % 時 萃 取 率 最 高 為 93． 4 % 。故 研 究 中，確 定 ( NH4 ) 2 SO4 最優(yōu)質量分數(shù)為 25 % 。在保持乙 醇的用量為 1． 5 mL 和鹽的質量分數(shù)為 25 % 的條件 下，調節(jié)體系的 pH 值在 3 ～ 9，如圖 4 所示。pH 值 為 3 ～ 6 時，燈盞花乙素的萃取率逐漸升高，pH 值為 6 時，萃取率最高為 94． 3 % 。當 pH 值大于 7 時，燈 盞花乙素的萃取率較低。究其原因燈盞花乙素在弱 酸性條件下呈分子狀態(tài)，極性較小，在乙醇中的分配 比更大。當溶液 pH 值較低時燈盞花乙素上的羰基 會被質子化，pH 值較高時氫離子又會被電離，都會 形成極性較大的分子，分配比較低。故選擇 pH = 6． 0 為最優(yōu)條件。

在前人研究中，昆山舒美認為多使用 95 % 乙醇或三氯甲烷作為提取液，回流提取燈盞花乙素，然后提取液經 過旋蒸等方法濃縮，甲醇定容后進行分析。也有通 過大量甲醇超聲提取燈盞花乙素，進行檢測。該 方法使用甲醇提取之后，通過雙水相方法富集提取 液，簡單快速、準確性高，并且所使用的雙水相體系 綠色 環(huán) 保、易 于 放 大 研 究。 本 研 究 以 乙 醇 與 ( NH4 ) 2 SO4 制備雙水相體系，利用雙水相萃取提取 燈盞花乙素粗提液中的燈盞花乙素，并最終對燈盞 花乙素含量進行測定，研究表明雙水相體系具有良 好的凈化性能，能有效降低燈盞花提取液中的大分 子物質和極性分子的干擾。研究結果為燈盞花中燈 盞花乙素的提取、含量測定提供了一種綠色環(huán)保、簡 單有效的方法。

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