20 世紀(jì) 90 年代中期，我國出現(xiàn)了應(yīng)用酶技術(shù)分 離中草藥有效成分的相關(guān)報道。近年來，應(yīng)用酶 技術(shù)提取分離中草藥的有效成分取得了不少新成果， 尤其是應(yīng)用纖維素酶以破壞細胞壁的致密結(jié)構(gòu)，加速 有效成分的溶出進而提高提取率的方法受到了行業(yè) 內(nèi)的認(rèn)可。目前已有許多科研工作者從中草藥中 分離出了有效的活性成分，如張利等利用纖維素酶提 取了廣陳皮中的橙皮苷; 孫曉玲利用纖維素酶結(jié)合乙 醇的提取方法，提取了生姜中的總黃酮; 薛天樂等利 用纖維素酶從白芷莖中提取了總香豆素。

1 材料與方法

1． 1 材料與儀器

羧甲基纖維素鈉和纖維素酶購于 Sigma 公司; 齊 墩果酸購于西安文竹生物科技有限公司; 3，5-二硝基 水楊酸、酒石酸鉀鈉、苯酚和無水亞硫酸鈉均購于國 藥集團化學(xué)試劑有限公司; NaOH 購于西隴化工股份 有限公司。 UV-2700 紫外分光光度計購于島津公司; HH-4 數(shù)顯恒溫水浴鍋購于江蘇省金壇市友聯(lián)儀器研究所; 昆山舒美KQ-700DA 超聲波清洗器購于昆山舒美超聲儀器有 限公司; BS224S-CW 電子分析天平購于賽多利斯; GFL-230 恒溫鼓風(fēng)干燥箱購于天津萊伯特瑞公司; TSE320V 超 低 溫 冰 箱 購 于 Thermo Scientific 公 司; S220-BiopH 計購于梅特勒公司。

1． 2 纖維素酶活力單位定義

1 mL 酶溶液在40 ℃、pH 4． 6 的條件下，1 min 從 底物中降解釋放 1 mg 還原糖，即為 1 個酶活力單位 ( U/mL) 。

1． 3 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制取

6 支具塞刻度試管，準(zhǔn) 確 配 置 0、200、300、 400、500、600 mg /L 葡 萄 糖 溶 液，每 管 加 入 2 mL， 40 ℃水浴 5 min，分別加入 DNS 溶液 0． 50 mL，沸水 浴 5 min 后 冷 卻，加蒸餾水定容至 10． 00 mL，于 540 nm處測量吸光度。

1． 4 纖維素酶活性測定

1． 4． 1 纖維素酶質(zhì)量濃度的篩選

向 7 支試管內(nèi)分別加入 0． 30 mL 羧甲基纖維素 鈉溶液( 終濃度為 10． 00 g /L) ，再依次加入終濃度為 0． 16、0． 32、0． 48、0． 64、0． 80、0． 96 和 1． 12 g /L 的纖 維素酶溶液 0． 30 mL，pH 4． 6 的條件下，40 ℃ 水浴 25 min使羧甲基纖維素鈉溶液與纖維素酶充分反應(yīng)。 分別加入 DNS 溶液 0． 50 mL，沸水浴 5 min 后冷卻， 加蒸餾水定容至 10． 00 mL。測定不同質(zhì)量濃度的纖 維素酶與羧甲基纖維素鈉溶液的反應(yīng)關(guān)系，篩選最佳 的酶質(zhì)量濃度進行下一步實驗。

1． 4． 2 反應(yīng)時間的篩選

向 5 支試管中分別加入質(zhì)量濃度為 10． 00 g /L 的羧甲基纖維素鈉溶液 0． 30 mL 以及“1． 4． 1”中篩 選出的適合質(zhì)量濃度的纖維素酶 0． 30 mL，pH 4． 6 的 條件下，40 ℃水浴 5、10、15、20 和 25 min。分別加入 DNS 溶液0． 50 mL，沸水浴5 min 后冷卻，加蒸餾水定 容至 10． 00 mL。觀察不同反應(yīng)時間對纖維素酶活性 的影響，篩選出纖維素酶的最適反應(yīng)時間并進行下一 步實驗。

1． 4． 3 羧甲基纖維素鈉、纖維素酶以及齊墩果酸加樣順序的篩選

以“1． 4． 1”篩選的酶質(zhì)量濃度以及“1． 4． 2”篩選 的反應(yīng)時間為基礎(chǔ)，將羧甲基纖維素鈉、纖維素酶和 齊墩果酸按下列 3 種順序加樣( 纖維素酶與羧甲基 纖維素鈉的體積為 0． 30 mL，齊墩果酸的體積 為 0． 30 mL，質(zhì)量濃度為 1 mmol /L) : ①pH4． 6 的條件 下，分別將羧甲基纖維素鈉、纖維素酶和齊墩果酸于 40 ℃水浴后一同加入到試管中反應(yīng); ②pH 4． 6 的條 件下，羧甲基纖維素鈉和齊墩果酸混合后 40 ℃水浴， 再加入纖維素酶溶液進行反應(yīng); ③pH 4． 6 的條件下， 齊墩果酸和纖維素酶溶液混勻后 40 ℃ 水浴，再加入 羧甲基纖維素鈉進行反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后加入 DNS 溶 液 0． 50 mL，沸水浴 5 min，冷卻后定容至 10． 00 mL。 在 540 nm 處測定溶液的吸光度值，比較 3 種加樣方 式抑制效果，選出最佳加樣順序。

1． 4． 4 最優(yōu)條件下齊墩果酸對纖維素酶的影響

取 5 支試管分別加入質(zhì)量濃度為 1． 00 mmol /L的齊墩果酸溶液 0． 10、0． 15、0． 20、0． 25 和 0． 30 mL， 加蒸餾水至 0． 30 mL，按照“1． 4． 3”所得的最佳方法 添加羧甲基纖維素鈉和纖維素酶各 0． 30 mL，pH 4． 6 的 條 件 下，40 ℃ 水 浴 5 min 后 加 入 DNS 溶 液 0． 50 mL，沸水浴 5 min，冷卻后定容至 10． 00 mL， 540 nm 處測定各溶液的吸光度值。計算纖維素酶活 力及齊墩果酸對纖維素酶活力抑制率。

2 結(jié)果與分析

2． 1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

以濃度為橫坐標(biāo)( X) ，吸光度值為縱坐標(biāo)( Y) ， 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為 Y = 0． 001X － 0． 004 4， R2 = 0． 995 4。隨著葡萄糖濃度的增加，吸光度值逐 漸增加，還原糖在 200 ～ 600 mg /L 范圍內(nèi)線性關(guān)系良 好，可以用于酶活力測定。

2． 2 纖維素酶質(zhì)量濃度對酶活力的影響

結(jié)果顯示，在 0． 16 ～ 0． 80 g /L 范圍內(nèi)隨著纖維 素酶質(zhì)量濃度逐漸升高，酶活力逐漸增強。纖維素酶 質(zhì)量濃度在 0． 16 ～ 0． 48 g /L 和 0． 64 ～ 0． 80 g /L 范圍 內(nèi)酶活力升高明顯，在 0． 48 ～ 0． 64 g /L 范圍內(nèi)酶活 力升高平緩。纖維素酶質(zhì)量濃度為 0． 80 g /L 時對底物的反應(yīng)活力最高，選擇該濃度為后續(xù)反應(yīng)濃度。

2． 3 纖維素酶反應(yīng)時間對酶活力的影響

結(jié)果顯示，隨著反應(yīng)時間的延長，纖維素酶活力 逐漸降低。反應(yīng)時間在 5 ～ 25 min 范圍內(nèi)纖維素酶 活力呈逐漸下降趨勢。反應(yīng)時間在 5 ～ 10 min 以及 20 ～ 25 min 范圍內(nèi)纖維素酶活力下降最快，反應(yīng)時間 在 10 ～ 20 min 范圍內(nèi)纖維素酶活力下降緩慢。反應(yīng) 時間為 5 min 時纖維素酶活力最高，可作為后續(xù)實驗 反應(yīng)時間。

2． 4 加樣順序?qū)w維素酶活力的影響

本研究考慮了 3 種加樣方法，觀察齊墩果酸對酶 活力的影響。結(jié)果顯示，不同加樣順序?qū)w維素酶活 力有很大影響。羧甲基纖維素鈉和齊墩果酸先加熱， 再加入纖維素酶加樣方法纖維素酶活力最低; 齊墩果 酸和纖維素酶先加熱，再加入羧甲基纖維素鈉的方法 纖維素酶活力最高; 羧甲基纖維素鈉、纖維素酶和齊 墩果酸同時加入試管的方法纖維素酶活力介于前兩 種方法之間。表明齊墩果酸對纖維素酶的抑制作用 是通過其與底物相互作用，進而阻礙了底物與酶的作 用，最終影響酶活性。齊墩果酸對酶和底物的作用也 不屬于競爭性抑制作用。齊墩果酸與底物先預(yù)處理， 然后在與酶反應(yīng)的方法對酶活力的抑制效果最佳，可 用于后續(xù)實驗檢測。此外，通過加樣順序的檢測發(fā) 現(xiàn)，齊墩果酸對纖維素酶的抑制作用明顯弱于其對底 物的抑制作用。

2． 5 最優(yōu)條件下齊墩果酸對纖維素酶酶活力的影響

結(jié)果顯示，隨著質(zhì)量濃度的升高，齊墩果酸對纖 維素酶活力的抑制率逐漸降低，在 0． 15 mmol /L 時纖 維素酶抑制率最低。當(dāng)質(zhì)量濃度從 0． 15 mmol /L 升 至 0． 30 mmol /L 時纖維素酶抑制率又逐漸上升。在 質(zhì)量濃度為 0． 20 ～ 0． 30 mmol /L 范圍內(nèi)齊墩果酸對 纖維素酶有明顯的抑制作用。齊墩果酸對纖維素酶 活力的抑制率的范圍為 19． 4% ～ 82． 4% 。

3 結(jié) 論

纖維素酶質(zhì)量濃度為 0． 80 g /L 時對底物的反應(yīng) 活力最高; 反應(yīng)時間為 5 min 時纖維素酶活力最高;以羧甲基纖維素鈉和齊墩果酸先加熱，再加入纖維素 酶這種加樣順序?qū)γ富畹囊种菩Ч罴?。在質(zhì)量濃 度為 0． 10 ～ 0． 30 mmol /L 范圍內(nèi)齊墩果酸對纖維素 酶有明顯的抑制作用，但齊墩果酸對纖維素酶的抑制 作用為非競爭性抑制，即齊墩果酸是與酶活性中心以 外的基團結(jié)合，這種結(jié)合對酶活性的影響較小。本研 究表明，齊墩果酸不會影響纖維素酶的提取效率，可 以利用纖維素酶從天然植物中分離提取齊墩果酸。




 

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